Determinazione della mitocondriale Oxygen Species potenziale di membrana e reattiva in neuroni corticali di ratto dal vivo

L'obiettivo di questa procedura è determinare il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di specie reattive dell'ossigeno in neuroni corticali primari, utilizzando rispettivamente le sonde fluorescenti TMRM e H2DCFDA. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto le concentrazioni stock e di lavoro di TMRM e H2DCFDA. Il secondo passaggio consiste nell'incubare i neuroni corticali con TMRM e H2DCFDA a temperatura ambiente per 45 minuti in buffer Thai roads.

Il terzo passaggio consiste nell'acquisire l'intensità di fluorescenza di TMRM e DCF in neuroni corticali vivi utilizzando rispettivamente eccitazione/emissione di 515/517 nanometri e 488/515 nanometri. Le variazioni della fluorescenza di TMRM verranno monitorate in presenza dell'uncoupler mitocondriale FCCP, mentre le variazioni della fluorescenza di DCF verranno monitorate in presenza di perossido di idrogeno. L'ultimo passaggio di questa procedura è la raccolta, la normalizzazione e l'analisi dei dati.

In definitiva, i risultati si ottengono tracciando un grafico che mostra i livelli relativi dell'intensità di fluorescenza di TMRM e DCF prima e dopo il trattamento con FCCP e perossido di idrogeno, rispettivamente. Ciao, sono Joanna Koska. Benvenuti nel mio laboratorio della Loyola University Chicago.

Oggi vi mostreremo come misurare il potenziale della membrana mitocondriale e le specie reattive dell'ossigeno nei neuroni corticali del ratto. La procedura sarà dimostrata da dhi. Ciao, sono Denise Jossi.

Utilizzando questa procedura, il potenziale della membrana mitocondriale può essere misurato a livello di singolo mitocondrio e le specie reattive dell'ossigeno a livello di singola cellula. Cominciamo. Preparare una soluzione madre di 10 millimolare di TMRM sciogliendo cinque milligrammi di TMRM in un millilitro di dimetilsulfossido anidro, quindi vortexare per un minuto.

Quindi effettuare aliquote e conservare le aliquote a meno 20 gradi Celsius. Proteggere dalla luce e utilizzare entro un mese. Successivamente, preparare una soluzione madre di 10 millimolare di H 2D CFDA sciogliendo 4,87 milligrammi di H 2D CFDA in un millilitro di dimetil solfossido anidro.

In modo analogo, vortexare per un minuto, quindi preparare aliquote e conservarle a meno 20 gradi Celsius. Proteggere dalla luce e utilizzare entro una settimana per caricare prima i neuroni corticali di ratto con TMRM. Lavare i neuroni in coltura tre volte con buffer di Tyrode.

Quindi preparare TMRM a 20 nanomolari diluendo il stock di TMRM a 10 millimolari 1000 volte nel tb. Aggiungere quindi due microlitri di TMRM diluito per ogni millilitro di tb. Incubare i neuroni con TMRM per 45 minuti al buio a temperatura ambiente.

Dopo 45 minuti, posizionare la piastra colturale sul palchetto del microscopio e iniziare l'acquisizione delle immagini per caricare i neuroni corticali di ratto con H 2D CFDA, quindi lavare i neuroni in coltura tre volte con tb. Successivamente, preparare una soluzione di H 2D CFDA a due micromolari diluendo il stock di H 2D CFDA a 10 millimolari di dieci volte in tb. Aggiungere quindi due microlitri di H 2D CFDA diluito per ogni millilitro di tb.

Quindi incubare i neuroni con H 2D CFDA per 45 minuti al buio a temperatura ambiente dopo 45 minuti. Lavare i neuroni quattro volte con TB per rimuovere l'eccesso di indicatore fluorescente prima di acquisire le immagini per eseguire l'immagine in tempo reale dei neuroni incubati con TMRM mediante microscopia confocale a scansione laser, utilizzando il programma di serie temporali in vivo. Applicare una risoluzione bassa e una potenza laser attenuata per ridurre al minimo il tempo necessario per acquisire le immagini e per evitare il fotoblesamento.

Successivamente, regolare il fuoco dei neuroni montati carichi di TMRM utilizzando la luce riflessa. Esaminare la fluorescenza del TMRM mediante illuminazione a 514 nanometri e rilevamento a 570 nanometri. Impostare il guadagno di rilevamento della telecamera appena al di sotto del livello di saturazione una volta stabiliti tutti i parametri, inclusi risoluzione, potenza del laser, guadagno della telecamera e intervallo di acquisizione temporale per ottenere le immagini.

Non modificare queste impostazioni tra un esperimento e l'altro. Successivamente, cambia il campo. Inizia a raccogliere immagini per verificare le variazioni dello stimolo delta PSY M; ad esempio, può essere applicato un micromolare di FCCP o due microgrammi per millilitro di oligomicina, che depolarizzeranno o iperpolarizzeranno significativamente il potenziale della membrana mitocondriale, rispettivamente.

Questi cambiamenti si manifesteranno con una diminuzione dell'intensità di fluorescenza di TMRM rispetto all'intensità di fluorescenza di base nel caso del FCCP, oppure con un aumento dell'intensità di fluorescenza di TMRM. Nel caso di una LIGA myin, per eseguire l'immagine in tempo reale di neuroni incubati con H 2D CFDA, montare innanzitutto la piastra colturale sul portacampioni del microscopio e regolare il fuoco sulle cellule utilizzando la luce riflessa. Esaminare la fluorescenza di DCF mediante eccitazione a 4 88 nanometri e emissione a cinque 15 nanometri.

Successivamente, regolare la potenza del laser al 5-7% per rilevare un guadagno e una risoluzione di 256 per 256. Non modificare queste impostazioni tra un esperimento e l'altro. Impostare quindi la frequenza per l'acquisizione di immagini in tempo reale.

Utilizzando il programma Time series, selezionare un nuovo campo e iniziare ad acquisire immagini per rilevare i cambiamenti nei livelli di ROS. Trattare le cellule con 100-200 micromoli di perossido di idrogeno. Questo si rifletterà in un aumento dell'intensità della fluorescenza di DCF rispetto al livello basale.

Utilizzare lo strumento di area di interesse del programma LSM per selezionare le aree. Quindi selezionare le ROI dalle regioni mitocondriali o le ROI dall'intero corpo cellulare nelle cellule dell'immagine, per misurare rispettivamente le intensità di fluorescenza di TMRM o delle ROS.

Selezionare le regioni adiacenti alle cellule. Per calcolare l'intensità di fluorescenza di fondo, effettuare diverse misurazioni e, per calcolare l'intensità media di fondo, sottrarre l'intensità media di fluorescenza di fondo dalle intensità medie di fluorescenza delle regioni di interesse in ciascuna cellula per ogni punto temporale utilizzando Microsoft Excel. Dopo aver sottratto l'intensità di fondo, normalizzare l'intensità di fluorescenza di TMRM o DCF alla fluorescenza di base.

Utilizzando questa formula, utilizzare quindi il programma Sigma Plot per generare il grafico che mostra le variazioni dell'intensità di fluorescenza nel tempo. Di seguito è riportato un esempio di un'immagine di fluorescenza di neuroni corticali di ratto incubati con TMRM. L'aggiunta di F-C-C-P-A, un disaccoppiatore mitocondriale, induce la depolarizzazione mitocondriale e una riduzione dell'intensità di fluorescenza di TMRM.

Il livello di fluorescenza basale di TMRM rimane stabile prima dell'aggiunta di FCCP. L'analisi quantitativa delle variazioni della fluorescenza di TMRM nel tempo mostra una diminuzione significativa della fluorescenza di TMRM dopo l'aggiunta di FCCP. Ecco un esempio di un'immagine di fluorescenza di neuroni corticali di ratto carichi di DCF.

Il livello di fluorescenza basale del DCF rimane invariato nei primi 120 secondi prima dell'applicazione del perossido di idrogeno. L'aggiunta di perossido di idrogeno provoca un aumento dell'intensità della fluorescenza del DCF nei corpi cellulari. Le misurazioni della fluorescenza del DCF effettuate a intervalli di tempo mostrano livelli costanti, aumentati dopo il trattamento con perossido di idrogeno.

In questa procedura, è importante ricordare di utilizzare una bassa potenza del laser e una velocità di scansione rapida per evitare artefatti dovuti allo sbiancamento fotochimico e alla fototossicità. Buona fortuna con il tuo esperimento.