Sette passi per Stellate Cellule
10 maggio 2011
Qui si descrive un metodo per l'isolamento delle cellule stellate epatiche dal fegato di topo. Per la purificazione delle cellule stellate, fegati mouse sono digeriti In situ E In vitro Da pronasi-collagenasi trattamento prima centrifugazione a gradiente di densità. Questa tecnica produce elevata purezza cellule stellate epatiche.
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule stellate epatiche dal fegato di topo. Questo viene ottenuto eseguendo innanzitutto una perfusione in C di fegati di topo con enzimi digestivi. Dopo la perfusione, i fegati vengono tagliati in piccoli pezzi per aumentare l'efficienza della digestione in vitro, che viene eseguita successivamente.
Come passaggio finale, le cellule stellate epatiche vengono separate dagli altri tipi cellulari epatici mediante centrifugazione su gradiente di densità. Alla fine, si ottengono le cellule stellate epatiche e la loro purezza può essere valutata mediante microscopia ottica e microscopia a fluorescenza. A dimostrare la procedura sarà Patrick Meyer, uno studente laureato di un laboratorio. In preparazione alla perfusione NC, riscaldare innanzitutto le soluzioni di buffer SC e di enzimi per la perfusione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.
Successivamente, impostare la pompa peristaltica per ottenere un flusso laminare di 6,5 millilitri al minuto ed equilibrare il tubo in silicone della pompa con la soluzione SC uno. A questo punto, verificare la perdita di riflessi per confermare che il topo anestetizzato sia profondamente sedato. Quindi, fissare il topo in posizione supina su una base adeguata.
Utilizzare forbici e pinze per eseguire un'incisione longitudinale nella cute addominale ed esporre il peritoneo. Aprire con attenzione il peritoneo e spostare gli intestini fuori dalla cavità addominale verso il lato sinistro dell'animale per esporre la vena porta. L'aspetto più difficile di questa procedura è la perfusione zeto del fegato con enzimi digestivi, che verrà dimostrata.
Successivamente, è importante utilizzare un microscopio stereoscopico durante l'inserimento della cannula e monitorare attentamente il cambiamento delle strutture epatiche durante la perfusione. Mentre si lavora al microscopio stereoscopico, inserire la cannula del set di infusione nella vena porta. Iniziare la perfusione del fegato con 30 millilitri di soluzione SC one. Aprire immediatamente la vena cava inferiore subito dopo l'avvio del flusso.
Un corretto lavaggio del fegato è indicato dalla perdita di colore del tessuto epatico. Successivamente, esaminare il fegato con 30 millilitri di soluzione di Pronase E. I lobi epatici si gonfieranno e i lobuli appariranno distinti attraverso la capsula dopo la perfusione con soluzione di Pronase E, seguita da una perfusione con 30 millilitri di soluzione di collagenasi P. Al termine della perfusione con collagenasi P, prelevare il fegato dal topo dissezionandolo con cura dal diaframma e dagli organi circostanti e conservarlo in 70 millilitri di soluzione SC due su ghiaccio.
Il fegato a questo punto ha perso la sua forma e appare atonico e amorfo. La procedura per la digestione dei fegati di topo deve essere eseguita in condizioni sterili. All'interno di una cappa a flusso laminare.
Utilizzare forbici affilate per tagliare i fegati in pezzi di circa due per due per due millimetri cubi. Quindi combinare la sospensione di 70 millilitri di SC due e i pezzi di fegato con 50 millilitri di soluzione di proteasi E collagenasi P. Aggiungere un millilitro di soluzione di dna, una e digerire i fegati per 20 minuti a 37 gradi Celsius sotto agitazione.
Dopo la digestione enzimatica del tessuto epatico, le cellule stellate vengono separate dagli altri tipi cellulari epatici mediante centrifugazione su gradiente di densità. Per iniziare questa procedura, filtrare la sospensione cellulare attraverso filtri cellulari da 70 micrometri in sei provette falcon da 50 millilitri e lavare le cellule con il tampone E due, centrifugando per 10 minuti a 600 G e a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, aspirare con attenzione 40 millilitri di sopranatante da ciascuna provetta.
Quindi aggiungere 150 microlitri di DNA's, una soluzione per ogni provetta, e risospendere le cellule. Riunire le sospensioni cellulari in quattro provette Falcon da 50 millilitri e lavare con G-B-S-S-P centrifugando per 10 minuti a 600 G e a 4 gradi Celsius. Aspirare con attenzione il maggior quantitativo possibile di supernatante senza disturbare il pellet e aggiungere 150 microlitri di DNAs one solution a ciascuna provetta.
Sospendiamo i pellet cellulari in 10 millilitri di G-B-S-S-B per tubo. Raccogliere le cellule in due tubi falcon da 50 millilitri e aggiungere G-B-S-S-B fino a un volume totale di 36 millilitri per tubo. Aggiungere 14 millilitri di soluzione den a ciascun tubo e mescolare accuratamente.
Successivamente, trasferire 10 millilitri della sospensione cellulare in un tubo da centrifuga a gradiente da 12 millilitri, ottenendo un totale di 10 tubi. Sovrapporre delicatamente alla sospensione cellulare 1,5 millilitri di G-B-S-S-B per ogni tubo. Centrifugare i gradienti per 15 minuti a 1500 G e a quattro gradi Celsius senza freno.
Successivamente, gli epatociti si depositeranno sul fondo del tubo, mentre le cellule stellate si troveranno all'interfaccia sotto forma di un anello bianco. Utilizzando una pipetta da cinque millilitri, raccogliere con attenzione l'interfaccia contenente le cellule stellate e trasferirla in un tubo da 50 millilitri. Lavare le cellule aggiungendo G-B-S-S-B e centrifugando per 10 minuti a 600 G e a quattro gradi Celsius.
Aspirare il soprannatante e risospendere le cellule in 20 millilitri di DMEM con integratori. Dopo aver contato le cellule, trasferirle in fiaschi per coltura cellulare a una concentrazione di due volte 10 alla quarta cellule per centimetro quadrato, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Circa due ore dopo la loro preparazione, le cellule stellate epatiche dovrebbero essere aderenti; cambiare il mezzo per rimuovere le cellule morte e i detriti cellulari.
Riportare le cellule nell'incubatore. Qui vengono mostrati i risultati rappresentativi della preparazione di cellule stellate epatiche da fegati di topo utilizzando questo protocollo. Le cellule al primo e al terzo giorno di coltura in vitro mostrano la morfologia caratteristica delle cellule stellate epatiche. Hanno una forma astrocito-simile ed esibiscono accumulo di vescicole lipidiche.
Nel sito nucleare per, la purezza delle cellule stellate epatiche isolate può essere verificata anche mediante l'espressione della proteina acida fibrillare gliale o GFAP. Queste immagini mostrano una colorazione immunofluorescente rappresentativa per GFAP, mostrata in rosso nelle cellule stellate epatiche, coltivate per tre giorni dopo l'isolamento cellulare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare le cellule stellate epatiche da fegato di topo per ottenere un rendimento adeguato di cellule stellate pure.
È importante garantire una digestione efficiente durante la perfusione epatica. Infine, è fondamentale determinare l'entità corretta delle cellule isolate valutando la morfologia e il fenotipo delle cellule epatiche.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per isolare le cellule stellate epatiche dal fegato di topo. Il processo prevede una perfusione con enzimi digestivi, seguita da digestione in vitro e centrifugazione su gradiente di densità per ottenere un'elevata purezza delle cellule.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biologia cellulare
- Ricerca epatica
- Isolamento di cellule staminali
Sfondo
- Le cellule stellate epatiche svolgono un ruolo cruciale nella fisiologia epatica.
- L'isolamento di queste cellule è essenziale per varie applicazioni di ricerca.
- I metodi tradizionali possono produrre popolazioni cellulari impure.
- Questo metodo mira a migliorare la purezza delle cellule isolate.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per l'isolamento delle cellule stellate epatiche.
- Migliorare la purezza delle cellule isolate ai fini della ricerca.
- Fornire un protocollo dettagliato per i ricercatori del settore.
Metodi Utilizzati
- Perfusione dei fegati di topo con enzimi digestivi.
- Digestione in vitro del tessuto epatico.
- Centrifugazione su gradiente di densità per la separazione cellulare.
- Valutazione della purezza cellulare mediante tecniche microscopiche.
Risultati principali
- È stata raggiunta un'elevata purezza delle cellule stellate epatiche.
- Il metodo consente una separazione efficace da altri tipi cellulari epatici.
- La purezza cellulare può essere valutata mediante microscopia ottica e immunofluorescenza.
- Il protocollo è riproducibile e può essere utilizzato da altri ricercatori.
Conclusioni
- Il metodo descritto è efficace per l'isolamento delle cellule stellate epatiche.
- Fornisce uno strumento prezioso per la ricerca epatica.
- Studi futuri possono basarsi su questa tecnica per diverse applicazioni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento delle cellule stellate epatiche consente una riduzione del rischio meccanicistica nella ricerca sulla fibrosi epatica e sull'immunometabolismo, fornendo un sistema purificato e rilevante per la patologia, utile alla validazione di bersagli terapeutici. Il metodo supporta lo sviluppo di modelli preclinici e la standardizzazione dei saggi, migliorando l'affidabilità predittiva nei test terapeutici. Questo flusso di lavoro colloca la preparazione delle cellule stellate come passaggio fondamentale per la scoperta di biomarcatori traslazionali e l'analisi dei percorsi metabolici nella scoperta di farmaci focalizzata sull'epatologia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei percorsi mediati dalle cellule stellate coinvolti nella fibrosi e delle funzioni di presentazione dell'antigene per la verifica di ipotesi mirate.
- Valore operativo: Fornisce una popolazione cellulare omogenea per ridurre la variabilità negli studi iniziali di interazione con il bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce cellule stellate con morfologia dei droplet lipidici preservata ed espressione di GFAP per letture di saggi funzionali.
- Valore operativo: Fornisce preparazioni cellulari riproducibili adatte allo screening ad alto contenuto informativo e al profilo di librerie di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione rilevante per le malattie della fibrosi epatica e della modulazione immunitaria nella validazione preclinica.
- Valore operativo: Permette la produzione scalabile di cellule stellate per studi longitudinali di farmacocinetica e farmacodinamica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo cellule stellate validate per la conferma del bersaglio, lo sviluppo di saggi e la riduzione del rischio meccanicistica prima dell'identificazione del composto leader.
- Biologia della scoperta: Facilita la chiarificazione dei percorsi e la validazione funzionale dei bersagli mediante l'isolamento di cellule stellate purificate.
- Screening: Permette la preparazione del saggio attraverso sospensioni cellulari standardizzate e pure per il test di composti.
- Analisi: Supporta la valutazione quantitativa della purezza cellulare e degli stati di attivazione mediante colorazione per GFAP e imaging delle goccioline lipidiche.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla continuità preclinica attraverso modelli di fibrosi mediata da cellule stellate e interazioni immunitarie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di isolamento riutilizzabile per programmi di scoperta focalizzati sull'epatologia in progetti multipli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie alla riduzione dell'eterogeneità cellulare negli studi sulle cellule stellate.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità dell'isolamento delle cellule stellate, che consente coerenza tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o abbandono dei progetti mediante la riduzione dei rischi associati agli obiettivi di fibrosi e immunologia nelle fasi iniziali della scoperta.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione dei terapeutici mirati al fegato, aggiustata per il rischio, basata su dati meccanicistici relativi alle cellule stellate.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di perfusione, digestione enzimatica e centrifugazione su gradiente di densità.
- È subordinato all'accesso a strumentazione per la perfusione, filtri cellulari, centrifughe e preparazione del gradiente di Nycodenz.
- Necessita della standardizzazione delle concentrazioni enzimatiche, dei tempi di digestione e dei parametri di centrifugazione tra i diversi gruppi di lavoro.
- Le considerazioni per l'adattamento includono le velocità di perfusione specifiche per specie e la potenza del collaghenasi nei modelli non murini.
- I limiti pratici comprendono la durata del flusso di lavoro multiplo e la sensibilità alla sovradigestione enzimatica, che influisce sul rendimento cellulare e sulla vitalità.
