Visualizzazione di MG53-mediata di riparazione della membrana cellulare Utilizzando In vivo E In vitro Sistemi

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la capacità di riparazione della membrana sia negli animali che nelle cellule isolate. Vengono raccolte fibre muscolari scheletriche isolate e circondate da un mezzo contenente il colorante FM 1-43. Successivamente, un laser UV viene utilizzato per irradiare e danneggiare una porzione della membrana cellulare, consentendo l'ingresso del colorante all'interno della cellula.

Le cellule isolate vengono trasfettate con DNA plasmidico che esprime GFP MG 53, la quale si localizzerà sulla membrana plasmatica e nel citosol della cellula. La punta di un microelettrodo viene quindi inserita nella membrana C two C 12 per indurre un danno. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano la traslocazione di GFP MG 53 verso il sito di lesione.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché richiede pratiche necessarie per padroneggiare le tecniche di penetrazione con microelettrodi e di isolamento delle fibre muscolari. La procedura sarà dimostrata dal dottor Lin, responsabile del laboratorio, dal dottor Wazu, ricercatore post-dottorato, da Matt Orange, studente laureato, e dalla dottoressa Shaza, professore associato di ricerca nel nostro dipartimento. Per iniziare, posizionare un vassoio o un tappetino da laboratorio blu sotto il tapis roulant per raccogliere i rifiuti provenienti dagli animali durante l'esperimento.

Successivamente, impostare l'angolo della superficie del tapis roulant. Alcuni tapis roulant dispongono di un dispositivo integrato per regolare l'inclinazione, mentre altri richiedono che il tapis roulant venga sollevato mediante altri metodi. Generalmente si utilizza una superficie piana o un angolo compreso tra sette e 15 gradi in discesa o in salita.

Abituare i topi posizionandoli sul tapis roulant con la griglia elettrica spenta e il motore del nastro acceso, ma fermo, per 15 minuti. Trascorso il periodo di abituazione, accendere la griglia elettrica di stimolo. Avviare il tapis roulant con una velocità iniziale di circa cinque metri al minuto. Aumentando la velocità di uno a due metri al minuto ogni minuto, consentire all'animale un periodo di riscaldamento di cinque minuti.

Ripetere questo periodo di riscaldamento ogni giorno per tre-dieci giorni per aumentare l'aderenza durante il test. Per eseguire un esercizio acuto di esaurimento, aumentare progressivamente la velocità del tapis roulant fino al raggiungimento della velocità massima e monitorare i segni di esaurimento.

Un animale è considerato esausto quando trascorre più della metà del tempo lontano dal tapis roulant o cinque secondi consecutivi sulla griglia. Rimuovere il topo esausto e registrare il tempo totale di corsa. Allenamento dell'endurance.

I protocolli di corsa iniziano con la stessa procedura di riscaldamento. Tuttavia, la velocità massima è generalmente più bassa e i tempi di corsa possono essere piuttosto lunghi. Dopo il test, restituire i topi alla loro gabbia di provenienza e pulire il tapis roulant con etanolo al 70%.

Isolare lo strato superficiale del muscolo flessore breve delle dita dal piede per ulteriori analisi. Per prima cosa, praticare un'incisione cutanea lungo la linea mediana della pianta del piede, avendo cura di non danneggiare il muscolo sottostante. Successivamente, effettuare incisioni orizzontali e rimuovere la pelle.

Individuare il tendine bianco e piatto del muscolo FDB attaccato all'osso calcagno. Utilizzare una pinza per separare e quindi recidere il tendine vicino al punto di inserzione. Tirare delicatamente il tendine verso l'alto mentre si taglia ogni tessuto connettivo.

Individuare il punto in cui i tendini distali si dividono nei singoli dita. Recidere i tendini nel punto in cui si collegano allo strato più profondo del muscolo ed asportare il muscolo FDB. Porre il fascio muscolare FDB in un millilitro di soluzione di collagenasi preriscaldata a 37 gradi Celsius.

Fissare orizzontalmente il tubo su uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius e agitare a 200 giri al minuto per 65 minuti. Una digestione sufficiente è indicata dall'aspetto filamentoso e dal colore pallido. Tagliare l'estremità di una punta per pipetta da un millilitro per permettere al fascio digerito di passare attraverso.

Trasferire agevolmente il fascio in un tubo da centrifuga contenente circa 600 microlitri di Tyrode al 2,5% di calcio. Ruotare delicatamente il tubo per far staccare le fibre libere dal fascio.

Successivamente, tagliare l'estremità di una punta da pipetta da 30 microlitri in modo che il diametro sia solo leggermente inferiore a quello del fascio muscolare. Utilizzare questa punta per aspirare il fascio all'interno della pipetta e quindi spingerlo nuovamente nella soluzione. Ripetere questo procedimento fino a quando la maggior parte delle fibre non si sarà dissociata dal fascio.

Mescolare le fibre dissociate capovolgendo delicatamente il tubo. Prelevare la quantità desiderata e depositarla su una piastra con fondo in vetro delta T. Conservare le fibre rimanenti a quattro gradi Celsius per circa sei ore per utilizzi successivi e ulteriori studi.

Lasciare riposare indisturbata la piastra per cinque minuti. Questo permette alle fibre di aderire al fondo in vetro della piastra. Posizionare la piastra con fondo in vetro su un microscopio confocale dotato di laser UV.

Osservare le fibre al microscopio in contrastro di fase con un ingrandimento superiore a 100x per verificare la presenza di un normale pattern a striature e di una forma dritta simile a una bacchetta. Aggiungere al mezzo FM 1 43 o FM 4 64 styro perineum dies fino a una concentrazione finale di 2,5 micromolare. Orientare la fibra a un angolo di 45 gradi dall'alto a sinistra del campo visivo verso il basso a destra per indurre danno.

Irradiare un'area di cinque per cinque pixel della membrana plasmatica. Utilizzando un laser UV impostato alla potenza massima per cinque secondi, la regione irradiata deve tagliare la membrana plasmatica in modo che metà del quadrato di cinque per cinque sia all'interno della fibra, mentre il resto deve trovarsi all'esterno. Acquisire immagini dell'ingresso del colorante nella fibra a intervalli di cinque secondi ciascuno, per un massimo di cinque minuti. È possibile irradiare non più di tre fibre per piastra, poiché il colorante fluorescente verrà infine endocitato nella fibra e potrebbe complicare l'analisi dei dati.

Dopo aver utilizzato tre fibre, è necessario preparare una nuova piastra. Utilizzando un software di analisi, calcolare la variazione dell'intensità di fluorescenza in un'area di circa 200 micrometri quadrati per effettuare il confronto tra le fibre. Per ogni fotogramma va effettuato il seguente calcolo: delta F diviso F zero, dove F zero è la fluorescenza media della regione di interesse nel primo fotogramma acquisito e delta F è la variazione della fluorescenza in ciascun fotogramma successivo.

Utilizzare metodi standard per trasfettare le cellule con DNA plasmidico che esprime GFP MG 53. Successivamente, preparare le micropipette. Posizionare una capillare in Pyrex su una micropipetta.

Eseguire il prelievo e il trascinamento mediante programma preimpostato. Collegare la micropipetta a un manipolatore micrometrico a tre assi. Il mezzo viene rimosso dalla piastra delta T e sostituito con tampone Tyro privo di calcio 2,5 millimolari.

Posizionare la piastra contenente le cellule transfezionate su un microscopio confocale a scansione laser dotato di obiettivo ad immersione in olio 40x 1,3 NA. Indurre un danno acuto alle cellule vive inserendo la micropipetta nella membrana cellulare e successivamente ritraendola rapidamente dalla cellula. Acquisire immagini consecutive di cellule vive a intervalli di 1,54 secondi per quadro, per l'analisi dell'alterazione della membrana indotta dalla troponina.

Perfondere troponina 0,005% a un flusso di circa un millilitro al minuto direttamente sopra la cellula in fase di acquisizione. Il tapis roulant può essere utilizzato per misurare una riduzione della capacità di corsa. I topi knockout per MG 53 mostrati qui presentano una ridotta capacità di corsa a causa di danni al muscolo scheletrico.

L'estensione del danno causato dal laser UV dipende dalla capacità di riparazione della membrana della fibra osservata. Questa è una fibra prima della lesione in un topo normale. Quest'immagine è stata acquisita 200 secondi dopo e mostra una lesione lieve.

Una fibra muscolare derivata da topi knockout per MG 53, con capacità di riparazione della membrana compromessa, mostrerà un ingresso di colorante più significativo dopo il danno. Ecco un esempio di un tubulo miotubulare C2C12 indenne trasfettato con GFP-MG 53. La freccia in questa immagine indica le vescicole contenenti GFP-MG 53 che si muovono verso i siti di danno.

In questo esempio, la saponina è stata utilizzata per danneggiare la membrana plasmatica. Osservare la traslocazione della GFP MG 53 dal citosol alla membrana cellulare dopo la lesione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di isolare fibre muscolari di buona qualità con membrane sarali lisce e schemi di striature chiari.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la capacità di riparazione della membrana nei muscoli e nelle cellule in coltura.