Un semplice Hanging goccia Cultura protocollo cellulare per la generazione di sferoidi 3D

Lo scopo di questo esperimento è generare tessuti tridimensionali simili a steroidi. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo cellule coltivate e successivamente generando una sospensione di singole cellule. Successivamente, delle gocce della sospensione cellulare vengono depositate sulla superficie inferiore del coperchio rovesciato di una piastra per colture cellulari.

Quindi il coperchio viene capovolto sulla camera di idratazione. L'ultimo passaggio consiste nell'incubare le gocce sospese per 24-48 ore per consentire la formazione di aggregati. Questi possono quindi essere trasferiti in un bagnomaria agitato e incubati fino a cinque giorni aggiuntivi.

Infine, è possibile ottenere risultati che evidenziano differenze nella coesione degli aggregati o nel riposizionamento cellulare mediante saggi di compattamento, analisi della simmetria della superficie del tessuto o microscopia a epifluorescenza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come ad esempio la coltura convenzionale di tessuti in 2D, è che le cellule coltivate in 3D riproducono in modo più accurato le interazioni cellulari che le cellule sperimentano in un ambiente tissutale. Dimostrerò questo metodo per mostrarvi che è così semplice che persino un responsabile di ricerca (PI) può eseguirlo.

Per iniziare questo esperimento, raccogliere le cellule aderenti al 90% di confluenza. In primo luogo, aspirare il terreno di coltura e risciacquare il foglietto cellulare due volte con PBS. Quindi, aspirare il PBS e pipettare due millilitri di tripsina 0,05% in soluzione di EDTA sul monostrato.

Posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e incubare fino al distacco delle cellule. Successivamente, rimuovere la piastra dall'incubatore e arrestare l'azione. Aggiungere due millilitri di mezzo completo.

Utilizzare una pipetta da cinque millilitri per tritare la miscela fino a quando le cellule non sono completamente in sospensione. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri. Pipettare 40 microlitri di una soluzione di DNA da 10 milligrammi per millilitro nella sospensione cellulare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti dopo l'incubazione.

Vortexare brevemente la sospensione cellulare, quindi centrifugare a 200 ×g per cinque minuti. Al termine della centrifugazione, aspirare il soprannatante S e scartarlo, quindi risospendere il pellet in un millilitro di mezzo completo per il lavaggio. Ripetere la centrifugazione e risospendere il pellet in un millilitro di mezzo completo.

Successivamente, eseguire un conteggio cellulare utilizzando un contatore cellulare automatico o un emocitometro. Regolare la sospensione cellulare con il mezzo fino a una concentrazione finale di 2,5 × 10⁶ cellule per millilitro. Procedere quindi alla formazione delle gocce sospese.

Preparare una camera di idratazione rimuovendo il coperchio da una piastra per colture cellulari da 60 millimetri e pipettando cinque millilitri di PBS sul fondo della piastra. Capovolgere il coperchio della piastra e pipettare fino a 20 gocce da 10 microlitri di sospensione cellulare sulla parte inferiore del coperchio. Assicurarsi che le gocce siano posizionate a una distanza sufficiente in modo da non toccarsi.

Rimettere delicatamente il coperchio contenente le colture a goccia sulla parte inferiore della piastra contenente il PBS. Posizionare la piastra di coltura in un incubatore per colture cellulari, impostato a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 95% di umidità, e incubare durante la notte.

Monitorare le gocce quotidianamente e proseguire l'incubazione fino a quando si saranno formati fogli cellulari o aggregati. Una volta formati i fogli cellulari o gli aggregati, trasferirli in fiale di vetro con fondo rotondo contenenti tre millilitri di mezzo completo. Incubare le fiale contenenti i fogli cellulari o gli aggregati in un bagnomaria agitato.

Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per circa 24 ore, fino a quando la formazione di steroidi può essere visualizzata al microscopio stereoscopico. Una volta formati gli steroidi, l'effetto delle manipolazioni sperimentali sulla loro formazione può essere quantificato seguendo la procedura descritta nel protocollo scritto. Inoltre, l'intercalazione nella membrana di eventuali coloranti fluorescenti precedentemente aggiunti può ora essere visualizzata mediante microscopia a fluorescenza.

Questa immagine al microscopio in campo chiaro mostra l'aggregazione di cellule di carcinoma prostatico del ratto MLL dopo 18 ore di incubazione con il metodo della goccia sospesa. Questa immagine mostra un secondo aggregato di cellule MLL formato dopo 18 ore di coltura mediante il metodo della goccia sospesa. Queste cellule sono state coltivate in presenza di 25 micromolar del inibitore della MEK PD 9 8 0 5 9, che ha determinato un aggregato cellulare notevolmente più compatto.

Qui viene mostrata la differenza tra la coltura in goccia sospesa di MLL trattata con inibitore MEK, la dimensione degli aggregati e quella degli aggregati di controllo non trattati. L'asterisco indica una differenza statisticamente significativa con P minore di 0,0001. Come determinato dal test t di Student tra aggregati non trattati e aggregati trattati con inibitore MEK, ciò suggerisce che il trattamento con inibitore MEK produce aggregati significativamente più piccoli e compatti.

Questa immagine è stata acquisita utilizzando un microscopio stereoscopico Nikon Smz 800 e illustra un aggregato formato incubando cellule epatiche di embrione di pollo in coltura a goccia sospesa per 18 ore, seguita da un bagno a 37 gradi Celsius con agitazione per 48 ore. Questa immagine al microscopio confocale dimostra il comportamento di separazione che si verifica quando determinate popolazioni cellulari vengono co-coltivate con il metodo della goccia sospesa; prima della coltura a goccia sospesa, le cellule epatiche di embrione di pollo sono state marcate con il colorante pkh due per la marcatura della membrana e con cellule epatiche di embrione di pollo.

Le cellule cardiache sono state colorate con PKH 26. Le sospensioni cellulari sono state quindi mescolate e poste in goccia sospesa. La coltura è stata eseguita per 18 ore, seguita da 48 ore di incubazione a 37 gradi Celsius in bagnomaria agitata.

Si può osservare dalla sezione ottica che le cellule cardiache colorate in giallo sono avvolte da cellule epatiche. Colorate artificialmente in blu, due linee di cellule L trasfettate e cloni cellulari esprimenti NCA sulle loro superfici. In un rapporto di 2,4 a 1, sono state colorate con coloranti fluorescenti per membrane, PKH2 e PKH26 mescolati in proporzioni uguali e coltivate come gocce sospese come in precedenza.

In questo esempio, le cellule che esprimono alti livelli di cadian, colorate artificialmente di verde, sono circondate da quelle che esprimono livelli più bassi di en cadian, colorate artificialmente di rosso. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti o meno se effettuata correttamente.