Un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da Mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere diverse colture di macrofagi da colture primarie miste di cellule epatiche di ratto, senza la necessità di attrezzature complesse o competenze specialistiche. Questo risultato si ottiene innanzitutto dissociando le cellule epatiche di ratto adulte mediante perfusione con collaghenasi, seguita dall'isolamento della frazione cellulare di epatociti parenchimali. Successivamente, le cellule vengono incubate in fiaschi per colture cellulari di superficie 75 cm² (T 75) con mezzo di crescita per stabilire colture primarie miste di cellule epatiche.

Dopo 10-12 giorni di coltura, i flaconi di coltura vengono agitati per facilitare il trasferimento dei macrofagi in piastre di plastica, da cui vengono quindi raccolti mediante adesione selettiva dopo un breve periodo di incubazione. Infine, più di 106 cellule possono essere raccolte ripetutamente dagli stessi flaconi di coltura tissutale T75 a intervalli di due-tre giorni per un periodo superiore a due settimane. I metodi di isolamento dei macrofagi epatici sono stati ampiamente descritti.

Tuttavia, la maggior parte dei metodi precedenti richiede attrezzature sofisticate come un centrifugo illustratore e competenze tecniche avanzate. Presentiamo qui un metodo semplice e innovativo per ottenere macrofagi epatici in numero e purezza sufficienti da colture primarie miste di cellule epatiche adulte avvolte, che non richiede attrezzature speciali né competenze di laboratorio avanzate. La dissezione dell'animale, la perfusione del fegato e la preparazione delle cellule saranno dimostrate dai dottori Norco, Yamanaka e Miko Yoshioka presso l'Istituto Nazionale di Sanità Animale.

Successivamente, il dottor Taketo Takeno presso l'Istituto Nazionale di Scienze Agrobiologiche mostrerà l'isolamento e la purificazione dei macrofagi epatici dai rischi culturali. Cominciamo dunque. Per preparare la perfusione del fegato del ratto, iniziare preriscaldando una bottiglia di soluzione lavante e una bottiglia di soluzione di collaghenasi.

Successivamente, dopo aver confermato la sedazione mediante pizzicamento cutaneo, posizionare un ratto maschio adulto anestetizzato in un vassoio di acciaio inossidabile e spruzzare etanolo al 70% sull'addome e sul torace. Poi, praticare un piccolo taglio al centro dell'addome con forbici da dissezione e sollevare la pelle. Quindi, aprire l'addome con le forbici e verificare la posizione della vena porta.

Successivamente, passare il filo chirurgico sotto la vena porta e stringerlo leggermente. Quindi clampare la parte distale della vena cava inferiore e della vena mesenterica con una pinza emostatica per prevenire il reflusso di sangue nel fegato. Aprire la cavità toracica tagliando il diaframma con forbici e, dopo aver praticato una piccola incisione nella vena porta con forbici oftalmiche, esporre il cuore, inserire un catetere di plastica di due millimetri nella vena e stringere saldamente il filo intorno al catetere.

Caricare un sistema di perfusione con la soluzione di lavaggio preriscaldata e quindi collegarlo al catetere. Iniziare la perfusione in C due a una velocità di 10 millilitri al minuto. Allo stesso tempo, effettuare un'incisione nella parete dell'atrio destro con forbici da dissezione.

Continuare la perfusione per 10 minuti, quindi sostituire la soluzione di perfusione con la soluzione di collaghenasi e perfondere per 10-20 minuti. Alla velocità di 10 millilitri al minuto, riempire un becher sterile con 25 millilitri di soluzione di collaghenasi. Successivamente, rimuovere il fegato perfuso e posizionarlo con attenzione nel becher.

Tagliare il fegato in piccoli pezzi con le forbici. Aggiungere 75 millilitri di MEM freddo nella sospensione cellulare ottenuta. Dopo un'accurata pipettatura, filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri.

Per rimuovere il tessuto connettivo nei frammenti di tessuto non digeriti, raccogliere il filtrato in provette coniche da 50 millilitri. Trasferire il filtrato in provette coniche da 50 millilitri e lavare le cellule quattro volte centrifugando prima le cellule a 50 G per un minuto a quattro gradi Celsius. Con la frenata disattivata, scartare con attenzione il soprannatante, quindi risospendere il pellet in MEM freddo e centrifugare nuovamente le cellule dopo l'ultimo lavaggio.

Risospendere le cellule epatiche nel mezzo di crescita. Seminare ora le cellule in cinque o dieci fiaschi da coltura tessutale di superficie 75 cm² ad una densità di 6,7 × 10⁴ cellule per centimetro quadrato. Posizionare i fiaschi di coltura in un incubatore e sostituire il mezzo di crescita ogni due o tre giorni.

Dopo un giorno di coltura, gli epatociti parenchimali si espandono sulla superficie della fiasca e mostrano una tipica morfologia poligonale simile a pietre calcaree, con uno o due nuclei rotondi. Entro pochi giorni di coltura, gli epatociti parenchimali perdono la loro morfologia da cellule epiteliali e si trasformano in cellule fibroblastiche più appiattite. Intorno al sesto giorno, al contrasto di fase, compaiono cellule rotonde e brillanti simili a macrofagi che iniziano a proliferare sul foglietto di cellule fibroblastiche. La crescita delle cellule simili a macrofagi raggiunge livelli massimi intorno al dodicesimo giorno.

Il numero di cellule di tipo macrofagico diminuisce intorno al giorno 19, quando il foglietto cellulare fibroblastico inizia a degenerare. Pertanto, intorno ai sette-dieci giorni di coltura, sospendiamo i macrofagi che si sono proliferati sul foglietto cellulare nel mezzo di coltura, agitando reciprocamente i flaconi di coltura per 30 minuti dopo aver risospeso i macrofagi. Distribuiamo il mezzo di due fiasche T75 in ciascuna delle piastre di plastica non adatte alla coltura tessutale da 100 millimetri.

Riempire nuovamente le fiasche di coltura con mezzo di crescita e riposizionarle nell'incubatore. Incubare le piastre di plastica per 30 minuti dopo il periodo di incubazione, quindi lavare le piastre tre volte aspirando il mezzo e risciacquando delicatamente la piastra di plastica con PBS, come mostrato qui, già a partire da 10 minuti dopo la semina, quando le cellule simili a macrofagi si sono attaccate alla superficie della piastra mentre altre cellule fibroblastiche contaminanti rimangono in sospensione. Dopo il risciacquo con PBS, si ottiene una popolazione di macrofagi altamente purificata.

Come mostrato in questa figura, le cellule assumono una tipica morfologia di macrofago dopo 40 minuti di coltura e frequentemente si osservano cellule in mitosi, come indicato dalle frecce. Per raccogliere questa nuova popolazione altamente purificata di macrofagi, aggiungere un millilitro di soluzione trip LE Express alle cellule lavate e riposizionare le piastre nell'incubatrice per ulteriori 10 minuti. Al termine di questo periodo di incubazione, aggiungere nove millilitri di mezzo di crescita, quindi staccare delicatamente i macrofagi aderenti con lo strumento raschiante e trasferirli in un tubo conico da 15 millilitri, centrifugare e scartare il soprannatante.

Aggiungere un millilitro di mezzo di crescita, dissociare gli aggregati cellulari risospesi in cellule singole mediante pipettaggio vigoroso, enumerare il numero di cellule utilizzando un emocitometro come mostrato in questo grafico; più di 10 delle sei cellule possono essere raccolte ripetutamente da un’ampolla di coltura T75 a intervalli di due-tre giorni per oltre due settimane, consentendo un rendimento cellulare totale di 10 alla settima per ogni ampolla di coltura T75. Come mostrato in queste immagini, le cellule isolate sono immuno marcate con anticorpi monoclonali contro antigeni di macrofagi di ratto, come CD68 o ED1 e CD172A o OX41. Queste cellule possiedono proprietà funzionali dei macrofagi, come la fagocitosi attiva di microperle marcate con FITC.

In questo video, abbiamo presentato un metodo semplice ed efficiente per ottenere macrofagi da colture primarie miste di cellule epatiche rosse adulte. La nostra procedura non richiede attrezzature o competenze complesse, ma fornisce un numero sufficiente di macrofagi puri che possono essere raccolti ripetutamente dalla stessa coltura di fegato. Questo metodo può essere applicato ad altre specie di mammiferi.

Grazie per aver guardato il video e buona fortuna nei vostri futuri esperimenti. Saluti.