Protocollo ottimizzato per Transfection efficiente delle cellule dendritiche, senza la maturazione delle cellule

L'obiettivo generale di questa procedura è ridurre l'espressione del gene bersaglio nelle DCS mediante trasfezione con siRNA. Questo viene ottenuto programmando innanzitutto l'effettore AM Maxin Nucleo. Il secondo passaggio della procedura consiste nel mescolare insieme DCS e siRNA e pipettare la soluzione cellulare risultante nei moduli Nucleo QVE.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel posizionare la piastra nel vassoio del dispositivo Amaxa per iniziare il processo di trasfezione. L'ultimo passaggio della procedura è infettare le cellule con il virus per attivare la risposta all'interferone. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano un abbattimento genico mediante R-T-P-C-R quantitativa e analisi Western blot.

Questa tecnica è utile per caratterizzare i percorsi di segnalazione nelle cellule dendritiche e potrebbe contribuire allo sviluppo di terapie immunitarie basate su cellule dendritiche. Per programmare il nucleofettore Maxon a 96 pozzetti per la trasfezione di DC, aprire un nuovo file di parametri. Selezionare il numero di pozzetti che si intende utilizzare per la trasfezione standard trascinando il cursore sulla figura della piastra a 96 pozzetti.

Utilizzare un minimo di tre pozzetti da raggruppare per ogni campione sperimentale. Ora inserire il codice del programma nella prima parte selezionando F, F e nella seconda parte i, selezionare 1 68 dai menu a tendina. Quindi, dalla casella delle soluzioni, selezionare monocita umano; successivamente, sotto l'opzione controllo, selezionare standard e quindi fare clic su applica.

Per includere un controllo senza trasfezione, è necessario selezionare ulteriori pozzetti dal diagramma. Quindi, dall'opzione di controllo, scegliere il controllo senza programma e fare nuovamente clic su applica. Dopo aver mescolato la soluzione di nucleo affezione, lasciarla riscaldare a temperatura ambiente.

Posizionare il numero di moduli nucleo vete necessari nella piastra nucleo VETE nell'orientamento corretto, come mostrato qui, inserendo il primo nei fori uno e due e procedendo allo stesso modo per tutti i tubi successivi. Trasferire una quantità sufficiente di DCS da un’ale di coltura cellulare in un tubo da 50 millilitri per ottenere 500.000 cellule per pozzetto per la trasfezione; centrifugare le cellule per 10 minuti a 400 ×g a quattro gradi Celsius, quindi rimuovere con attenzione il soprannatante. Successivamente, aggiungere la soluzione di nucleofezione al tubo e risospendere le DCS pipettando delicatamente su e giù per alcune volte.

Ora etichettare le provette eppendorf DPH in base al trattamento specifico da eseguire, quindi dividere le cellule risospese nelle provette etichettate. Aggiungere l'SI RNA a una concentrazione finale di 0,25 microgrammi per 500.000 cellule nelle provette eppendorf appropriate, quindi mescolare le sospensioni cellulari mediante pipettaggio. Utilizzare l'SI RNA non target come campione di controllo senza transfezione.

Quindi pipettare 20 microlitri della sospensione cellulare SI RA DC nei moduli nucleo vete secondo il layout sperimentale precedentemente programmato, assicurandosi che il liquido venga consegnato sul fondo della pozzetta. Coprire la piastra nucleo vete con un coperchio e battere leggermente la piastra su una superficie dura alcune volte per facilitare la rimozione delle bolle d'aria al fine di trasfettare le cellule dendritiche. Inserire la piastra nucleo Yvette preparata nel vassoio shuttle effettore nucleo a 96 pozzette. Quindi fare clic sul pulsante di caricamento e avvio.

Seguire l'andamento del processo di trasfezione sul display. Una croce nera su sfondo verde indica una trasfezione riuscita in quel pozzetto, mentre una barra nera su sfondo rosso indica un esito negativo durante la trasfezione delle cellule. Al termine del processo di trasfezione, preriscaldare il mezzo di crescita per le cellule dendritiche, rimuovere la piastra e aggiungere 80 microlitri del mezzo di crescita preriscaldato in ogni pozzetto.

Utilizzando una pipetta multicanale, incubare ora la piastra per 10 minuti a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Durante il periodo di incubazione, aggiungere 100 microlitri del mezzo di crescita per DC preriscaldato nei tubi matrice nella stessa orientazione utilizzata per il set della piastra di nucleocuvette. Al termine del periodo di incubazione, trasferire tutti i 100 microlitri delle sospensioni cellulari dalle nucleocuvette ai tubi matrice predisposti.

Quindi rimuovere e scartare i tubi in cui la trasfezione non è avvenuta. Infine, incubare i tubi della matrice per 24 ore o per un altro intervallo di tempo desiderato. Etichettare i tubi einor per ciascuno dei tubi della matrice in incubazione.

Quindi trasferire i tubi della matrice dall'incubatore all'area di lavoro laminare e unire i tubi della matrice per ciascun campione sperimentale nei eend dfs pre-etichettati. Successivamente, raccogliere delicatamente le cellule formando un pellet mediante centrifugazione dei tubi eend DPH in una centrifuga da banco per 10 minuti a 400 G. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in mezzo di crescita privo di siero contenente il virus della malattia di Newcastle o NDV a un MOI di uno, in modo approssimato.

Coprire gli epi-endorfini in modo sterile e quindi incubare i tubi per 45 minuti. Al termine di questo periodo di incubazione, aggiungere 900 microlitri di mezzo di crescita DC e ri-incubare i tubi per altre otto-dieci ore. Per raccogliere le DC transfettate e infette.

Centrifugare le cellule utilizzando provette eppendorf in una centrifuga da banco, come in precedenza, e rimuovere il soprannatante. I monociti sono stati trasfettati con siRNA specifico per RIG-I o con siRNA non specifico e infettati con NDV, come indicato da un segno più, oppure sono stati lasciati non infettati, come indicato da un segno meno, come rilevato mediante RT-qPCR. È stato osservato un abbattimento del 75% di RIGA a livello trascrizionale, con una riduzione simile nell'espressione dell'interferone beta. È stato inoltre osservato un abbassamento nell'espressione di un effettore downstream di RIGA nella cascata di segnalazione dell'interferone. Inoltre, l'espressione dell'interferone beta nelle cellule di controllo non infette e trasfettate non è risultata rilevabile.

Mentre quello di MXA e del gene della risposta downstream all'interferone beta era minimo. Qui vengono mostrati i dati di una seconda trasfezione di DCS con RNAi mirato a RIGI, eseguita come nella figura precedente. Tuttavia, tutte le cellule sono state infettate con NDV ed è stato incluso un ulteriore controllo utilizzando DCS monociti non resecati.

I risultati dell'interferenza genica erano simili a quelli osservati nella figura precedente. Un'analisi mediante western blot effettuata per rilevare RGA ha rivelato che l'espressione proteica di questo gene era stata completamente bloccata. Le corsie uno e due mostrano i dati relativi ai lisati ottenuti da cellule non resecate.

Le corsie tre e quattro mostrano lisati di cellule trasfettate con glow irna, mentre le corsie cinque e sei mostrano lisati di cellule trasfettate con S irna mirato a RIG I. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora, inclusa la silenziamento simultaneo di molti geni.