Generazione e l'etichettatura di Murine osseo cellule dendritiche derivate dal midollo con nanocristalli Qdot per gli Studi inseguimento

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare cellule dendritiche per studi di imaging mediante l'uso di nano cristalli Q dot. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto le cellule del midollo osseo dai femori e tibie di topo. Successivamente, vengono allestite colture di cellule del midollo osseo per favorire la differenziazione cellulare in cellule dendritiche in presenza di GM CSF.

Successivamente, le cellule dendritiche vengono recuperate dalle colture di cellule del midollo osseo dopo otto giorni. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'effettuare la colorazione delle cellule con nano cristalli fluorescenti Q. Infine, le cellule dendritiche fortemente colorate possono essere visualizzate mediante microscopia a fluorescenza.

Il principale vantaggio dell'utilizzo di questa tecnologia rispetto ad altri metodi, come l'uso di cellule dendritiche marcate con GFP, è che i nano cristalli Q dot conservano la loro fluorescenza anche dopo la colorazione con solventi organici come l'acetone. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali per i biologi delle cellule dendritiche, come ad esempio le proprietà di migrazione di queste cellule in diverse malattie o in contesti patologici differenti. La procedura di colorazione sarà dimostrata da Maria Ali, una studentessa laureanda del mio laboratorio.

Dopo l'eutanasia, dissezionare con cura la tibia e il femore di due topi senza recidere le estremità ossee. Quindi utilizzare carta da filtro per rimuovere tutti i tessuti aderenti dalle ossa, avendo cura di non romperle. In una cappa a sicurezza biologica.

Riempire una piastra di Petri da 35 millimetri con etanolo al 70% e immergere quindi le ossa nell'etanolo per 10 minuti. Dopo aver sterilizzato le ossa, recuperarle dall'etanolo e lasciarle asciugare all'aria per cinque minuti in una nuova piastra di Petri. A questo punto, tagliare il femore al centro e la tibia alla loro estremità più sottile.

Iniettare l'interno delle ossa con un millilitro di mezzo RPMI utilizzando una siringa sterile. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e lavarla due volte con mezzo RPMI mediante centrifugazione a 300 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga dotata di rotore a cestelli oscillanti. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule in due millilitri di tampone per la lisi dei globuli rossi (CK lysis buffer) e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente al fine di eliminare i globuli rossi.

Successivamente, aggiungere 13 millilitri di RPMI più 10% di FBS e lavare le cellule altre due volte in questo mezzo utilizzando le stesse impostazioni della centrifuga di prima. Contare le cellule e regolare la concentrazione a due volte 10 alla quinta cellule per millilitro. Con RPMI più 10% di FBS, aggiungere G-M-C-S-F murino ricombinante a una concentrazione finale di 20 nanogrammi per millilitro.

Quindi aggiungere 10 millilitri di questa sospensione in una piastra di Petri sterile da 10 centimetri di qualità microbiologica e coltivare. La sospensione cellulare in un incubatore a anidride carbonica. Tre giorni dopo, aggiungere altri 10 millilitri di RPMI più 10% di FBS con 20 nanogrammi per millilitro di G-M-C-S-F murino ricombinante a ciascuna delle piastre preparate.

Tre giorni dopo, recuperare 10 millilitri di sospensione cellulare da ogni piastra di Petri, centrifugare le cellule nelle stesse condizioni e risospendere il pellet nello stesso volume di RPMI aggiunto di 10% FBS prelevato dalle piastre di Petri, integrando con nuova G-M-C-S-F murina ricombinante. Infine, reinserire la sospensione cellulare in ciascuna piastra di Petri originale e coltivare le cellule per altri due giorni nell'incubatore a biossido di carbonio. Dopo otto giorni di coltura, recuperare le cellule in sospensione e quelle debolmente aderenti lavando le piastre di Petri con mezzo fresco.

Quindi etichettare le cellule raccolte con il kit di etichettatura cellulare Q tracker 655 seguendo rigorosamente le istruzioni del produttore per etichettare cinque volte 10 alla sesta di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo murino con nano cristalli Q a una concentrazione di 10 nano moli. Mescolare innanzitutto cinque microlitri di ciascuno dei componenti del kit A e B in una provetta eppendorf e incubare la miscela per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere un millilitro di RPMI più 10% di FBS e vortexare la provetta per 30 secondi.

Successivamente, aggiungere cinque volte 10 alla quinta di Dcs sospesi in 0,5 millilitri di RPMI più 10% FBS nel tubo einor e incubare le cellule nella soluzione D a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Quindi lavare le cellule due volte in RPMI più 10% FBS nelle stesse condizioni di prima e risospendere il pellet in RPMI.

Questa figura mostra un esempio di microfotografia fluorescente di dcs. Immediatamente dopo la marcatura, una goccia di cellule marcate è stata depositata su un vetrino e coperta con un coprioggetto. Successivamente, i campioni sono stati valutati utilizzando un microscopio a fluorescenza.

In questa figura, può essere osservata un'etichettatura in microfotografia fluorescente delle cellule dendritiche dopo 48 ore di maturazione in vitro. Le cellule dendritiche sono state coltivate per 48 ore con 100 nanogrammi per millilitro di LPS e 20 nanogrammi per millilitro di TNF-alfa in camere da coltura su vetrino, in un incubatore a anidride carbonica. Successivamente, i campioni sono stati lavati con PBS, fissati con acetone, controcolorati con DPI e valutati mediante microscopio fluorescente.

I DC marcati maturati in vitro sono stati analizzati mediante citometria a flusso. Le cellule marcate con Q dot mostrano un segnale intenso nel canale FL3. I DC marcati e non marcati con Q dot sono stati inoltre colorati con anticorpi specifici contro i marcatori di maturazione CD86 e CD40, e con controlli di isotipo. Le cellule sono state quindi analizzate mediante citometria a flusso. Inoltre, i livelli di IL-6 e di ossido nitrico sono stati determinati nei supernatanti dei DC maturati marcati con Q dot e nei controlli.

Di seguito è mostrata una figura rappresentativa di DCS marcate in un tessuto dissezionato. I DC maturi sono stati iniettati per via endovenosa in topi C57 Black Six. Dopo tre giorni, i topi sono stati sacrificati e le milze sono state raccolte.

Tagli di otto micron, congelati rapidamente in OCT, sono stati preparati utilizzando un criostato. I campioni sono quindi stati fissati con acetone, controcolorati con DPI e valutati mediante microscopio a fluorescenza. Successivamente a queste procedure.

Possono essere eseguiti altri metodi, come la presentazione dell'antigene o la maturazione con diversi stimoli, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio sulla migrazione delle cellule dendritiche in risposta a diversi stimoli di maturazione.