Quantificare la frequenza di tumori di moltiplicazione celle usando Limitare trapianto di cellule Diluizione in Singenico Zebrafish

L'analisi di trapianto cellulare con diluizione limite è lo standard di riferimento per valutare il potenziale di autorinnovamento nei modelli sperimentali animali. In questa dimostrazione, embrioni di zebrafish allo stadio di una singola cellula vengono iniettati con rag two MIC e RAG two GFP per generare zebrafish transgenici che svilupperanno una leucemia linfoblastica acuta T fluorescentemente marcata. A 60 giorni di vita, le cellule leucemiche primarie vengono isolate dai zebrafish e successivamente purificate mediante sorting cellulare attivato da fluorescenza.

Successivamente, le cellule vengono trapiantate in diluizione limite nella cavità peritoneale di zebrafish adulti, e i pesci vengono monitorati per la crescita tumorale fino a 90 giorni. Infine, si utilizza il programma statistico di analisi in diluizione estrema per quantificare la frequenza delle cellule propaganti la leucemia all'interno del tumore originale. L'analisi del trapianto cellulare in diluizione limite consente ai ricercatori di valutare con precisione il numero di cellule con capacità di autorinnovamento presenti all'interno della massa tumorale complessiva.

Sono queste cellule autoriproducenti a determinare la formazione del cancro e sono infine responsabili della ricaduta. Il principale vantaggio nell'eseguire saggi di trapianto in diluizione limitante nel modello di pesce zebra è che molti pesci possono essere trapiantati per ogni esperimento, ottenendo una maggiore precisione nella determinazione della frequenza delle cellule tumorali autoriproducenti. Questo metodo fornisce informazioni sulle cellule propaganti il tumore nella leucemia linfoblastica acuta a cellule T.

È inoltre applicabile per comprendere altri modelli di cancro nel pesce zebra. Jessica Blackburn, una ricercatrice del laboratorio, e Sally Liu, una tecnica esperta, vi mostreranno oggi la procedura. Per linearizzare i costrutti Rag2 CM e RAG2 GFP-DNA, digerire 10 microgrammi di ciascun plasmide con l'enzima di restrizione NotI a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'estrazione con fenolo-cloroformio e la precipitazione con etanolo, sospenderemo ciascun plasmide in 20 microlitri di acqua.

Determinare le concentrazioni di DNA su un gel all'1% di agarosio eseguendo una diluizione uno a uno, uno a cinque e uno a dieci di ciascun plasmide digerito con 20 microlitri, 10 microlitri e 5 microlitri di un DNA ladder ad alto intervallo. Diluire ora il DNA fino a una concentrazione finale di 60 nanogrammi per microlitro per l'iniezione nella ceppa CG uno di syngen. Iniettare in embrioni di pesce zebra 250 nanolitri di rag due CM a 30 nanogrammi per microlitro e 30 nanogrammi per microlitro.

Iniettare il DNA di Rag due GFP in embrioni di pesce zebra allo stadio a una cellula, mirando con attenzione direttamente nella cellula e non nel tuorlo. Conservare gli embrioni iniettati a 28,5 gradi Celsius ed eliminare gli embrioni morti dopo 24 ore; a cinque giorni di vita, trasferire gli animali in vasche più grandi circa 28 giorni dopo l'iniezione. Anestetizzare i larve di pesce zebra aggiungendo 200 microlitri di trica S a quattro nanogrammi per millilitro in 25 millilitri di acqua del sistema per pesci in una piastra di Petri.

Esaminare i larve per lo sviluppo di TALL marcati con fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza in epifluorescenza per rilevare la fluorescenza GFP. Separare le larve positive al tumore da quelle negative per assicurarsi che nessun pesce leucemico venga omesso nell'analisi. Le larve negative possono essere esaminate in un momento successivo, una volta che i tumori potrebbero essersi ingranditi. Monitorare i pesci leucemici marcati con fluorescenza almeno una volta alla settimana utilizzando il microscopio a fluorescenza in epifluorescenza per seguire la crescita del tumore.

Quando le cellule leucemiche positive al GFP hanno sopraffatto più del 50% dell'animale, aggiungere un millilitro di quattro nanogrammi per millilitro di Trica S in una piastra di Petri contenente nove millilitri di acqua per sistema ittico per sacrificare il pesce; posizionare il pesce in una nuova piastra di Petri contenente un millilitro di siero bovino fetale al 5% in PBS 0,9 X; macerare il pesce con una lametta, pipettare la miscela per dissociare gli aggregati cellulari più grandi, quindi far passare le cellule attraverso un setaccio da 40 micrometri in un tubo da 50 millilitri.

Aspirare 500 microlitri di cellule in un tubo di polistirene da quattro millilitri. Aggiungere un microlitro di ioduro di peridinio al milligrammo per millilitro per etichettare le cellule morte, vortexare, quindi mantenere le cellule sul ghiaccio. Preparare anche un pesce selvatico CG1 come controllo per raccogliere cellule sanguigne normali, che fungeranno da veicolo per le cellule tumorali durante il trapianto, aggiungendo quattro millilitri di FCS al 5% in PBS 0,9 X in un tubo da 50 millilitri per un volume totale di cinque millilitri.

Contare le cellule del sangue normale diluite a tre volte 10 alla quinta cellule per millilitro in FBS al 5% in PBS 0,9 x, quindi pipettare 100 microlitri per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti utilizzando un ordinatore cellulare attivato da fluorescenza per selezionare le cellule tumorali GFP positive e PI negative all'interno della piastra a 96 pozzetti contenente le cellule del sangue alle dosi indicate. In aggiunta, ordinare 10.000 cellule in un pozzetto senza cellule del sangue normali e riesaminare mediante FACS per valutare la purezza e la vitalità delle cellule ordinate. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 2000 ×g per 10 minuti per formare il pellet cellulare.

Rimuovere 95 microlitri del surnatante e risospendere le cellule nei rimanenti cinque microlitri. Iniettare la sospensione cellulare nella cavità peritoneale di zebrafish adulti sinnigenici di età superiore a 60 giorni utilizzando una microsiringa da 26 e mezzo gauge. Gli zebrafish non devono essere anestetizzati prima del trapianto.

Trapiantare 45 pesci con 10 cellule leucemiche, 20 pesci con 100 cellule, sette pesci con 1000 cellule e cinque pesci con 10.000 cellule TALL circa 28 giorni dopo il trapianto. Esaminare i pesci zebra riceventi con un microscopio a fluorescenza episcopica utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione 485/20 e un filtro di emissione 530/25 per rilevare la fluorescenza GFP.

Registrare il numero di pesci positivi rispetto al numero totale di pesci iniettati. Esaminare nuovamente i pesci ogni 14 giorni fino a un massimo di 90 giorni e registrare il numero di pesci positivi. Quando un pesce positivo per il tumore diventa più abbondante.

Sacrificare l'animale mediante sovradosaggio di trica US, inserire i risultati in una tabella e caricare i dati nel software web di analisi della diluizione estrema in limiti per determinare la frequenza delle cellule leucemiche autorinnovanti all'interno degli embrioni primari di TALL CG. Una linea di embrioni è stata iniettata con RAG due cmic e le larve RAG due GFP sono state analizzate per rilevare il TALL primario. Dopo 28 giorni, coerentemente con lavori precedenti, circa il 5% dei pesci iniettati presenta linfociti T GFP positivi nel timo, e il 100% di questi pesci svilupperà leucemia. Qui, cellule TALL marcate con fluorescenza sono state separate da animali malati di 65 giorni e utilizzate nel saggio di trapianto cellulare con diluizione limitante. In primo luogo, è stata tracciata una finestra per selezionare singole cellule.

Quindi sono state selezionate le cellule negative al propidio ioduro. E infine è stata tracciata una finestra per selezionare esclusivamente le cellule leucemiche positive per GFP da sottoporre a sorting. In questo esempio di pesci trapiantati con TALL al giorno 28, tumori in fase precoce sono stati osservati come un'area di cellule positive per GFP vicino al sito di iniezione.

Sebbene alcuni TLS fossero più avanzati, essendosi espansi fino a riempire la cavità peritoneale per questi esperimenti, sono stati trapiantati oltre 220 animali, procedura che può essere facilmente eseguita da una sola persona nell'arco di alcune ore. L'analisi dei dati mediante il software elda ha mostrato che, in media, una cellula T su 135 era una cellula leucemica autorinnovante in grado di propagare il tumore. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come trapiantare cellule tumorali in diluizione limitante nella cavità peritoneale di zebrafish sigenetici e di come utilizzare i dati risultanti per determinare la frequenza delle cellule propagatrici del tumore all'interno di un determinato tumore.

Ulteriori studi che utilizzano animali geneticamente modificati potrebbero contribuire a identificare i meccanismi che regolano l'auto-rinnovamento di queste cellule propagatrici del tumore.