Identificazione e analisi dei mouse progenitori eritroidi utilizzando il CD71/TER119 Flow-citometria Assay

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare direttamente i precursori dei globuli rossi in tessuti appena isolati da topi. Questo ci consente di studiarne le proprietà molecolari in momenti in cui il sistema eritropoietico di questi animali sta subendo cambiamenti. Ad esempio, durante lo sviluppo embrionale o in risposta a stress ipossico, il tessuto ematopoietico viene isolato dal fegato fetale del topo o dalla milza o dal midollo osseo adulto e dissociato in una sospensione di singole cellule.

Successivamente, le cellule vengono marcate con anticorpi contro i marcatori di superficie cellulare CD 71 e TER 119 e con altri marcatori di interesse, ad esempio per misurare la sopravvivenza cellulare o lo stato del ciclo cellulare; la sospensione di cellule marcate viene quindi analizzata mediante un analizzatore di citometria a flusso e vengono identificati specifici sottoinsiemi di eritroblasti a distinte fasi di maturazione. Questi sottoinsiemi specifici possono essere purificati mediante sorting cellulare. Successivamente, possono essere eseguite analisi cellulari e molecolari per ciascun sottoinsieme di maturazione degli eritroblasti.

La capacità di identificare eritroblasti in specifici stadi di maturazione direttamente in tessuti ematopoietici appena isolati ci offre l'opportunità di studiare queste cellule nella corteccia fisiologica. Questo metodo ci permette quindi di analizzare eritroblasti in diversi stadi di maturazione, osservandone la risposta in vivo. Quando i topi sono sottoposti a stimoli, accelerano il tasso eritropoietico.

Ad esempio, condizioni ipossiche che simulano l'alta quota o l'iniezione dell'ormone eritropoietina. Utilizziamo la citometria a flusso multiparametrica per identificare i blasti in un ambiente tissutale complesso e studiare contemporaneamente il loro stato di segnalazione, sopravvivenza e ciclo cellulare. Possiamo inoltre separare gli eritroblasti nei loro specifici stadi di maturazione direttamente da tessuto fresco ed esplorare i loro livelli di espressione genica, lo stato della cromatina o altre funzioni molecolari.

L'eritropoiesi definitiva nei topi avviene nella milza e nel midollo osseo del topo adulto. Pertanto, questi tessuti verranno prelevati da un topo sottoposto a eutanasia. Dopo l'eutanasia, prelevare il sangue mediante puntura cardiaca in provette per prelievo di sangue contenenti EDTA o eparina; questo sangue verrà utilizzato successivamente per il conteggio dell'ematocrito, il conteggio dei reticolociti o l'analisi dell'emocromo completo (CBC).

Posizionare la milza e il femore prelevati in tubi separati contenenti staining.Buffer freddo. Mantenere i tessuti prelevati sul ghiaccio, se desiderato. Pesare la milza.

I topi sottoposti a una risposta da stress eritropoietico mostrano probabilmente un aumento significativo del peso della milza. Successivamente, le cellule della milza e le cellule del midollo osseo vengono preparate dai tessuti raccolti mediante procedure già dimostrate nell'embrione di topo. L'eritropoiesi definitiva ha luogo nel fegato fetale tra i giorni embrionali 12,5 e 15,5.

Si preparano topi femmine incinte a tempo determinato per ottenere cellule del fegato fetale nei giorni 12,5-14,5 di gestazione. I topi femmine incinti a tempo determinato vengono soppressi e le corna uterine vengono asportate e poste in una piastra di Petri contenente ghiaccio. Mezzo di coltura freddo o tampone per colorazione.

È necessario un microscopio stereoscopico per dissezionare il fegato fetale dal giorno embrionale 12,5 o precedente, al fine di rimuovere gli embrioni dall'utero. Separare innanzitutto ogni embrione dal corno uterino. Quindi escindere delicatamente la parete dell'utero per liberare l'embrione contenuto nel suo sacco amniotico.

Staccare delicatamente la membrana amniotica. Il fegato fetale è il tessuto addominale rosso più grande, situato al di sotto di un cuore molto più piccolo. Per dissezionare il fegato fetale, utilizzare la pinzetta per immobilizzare l'embrione su entrambi i lati del fegato e spingere delicatamente il fegato fuori dall'addome nel mezzo.

Trasferire delicatamente il fegato in una provetta contenente tampone di marcatura fresco. Dopo aver dissezionato tutti i fegati fetali e trasferiti in una provetta contenente tampone di marcatura fresco, dissociare meccanicamente i fegati mediante pipettaggio, quindi filtrare le cellule dissociate attraverso un filtro in nylon da 40 micron. Lavare le cellule due volte mediante centrifugazione, eliminando il soprannatante e risospendendole nel tampone di marcatura.

Dopo il secondo lavaggio, colorare le cellule con tripan blu e contare utilizzando un emocitometro. Un fegato fetale a E 13,5 contiene circa 10 alla settima. Ri-sospendere le cellule a uno-due × 10⁶ cellule per campione di 200 µL per l'analisi citofluorimetrica.

Per gli scopi di questo protocollo video, la colorazione con anticorpi per citometria a flusso verrà dimostrata esclusivamente su cellule di fegato fetale. Per iniziare questa procedura, preparare una miscela preliminare di anticorpi primari contenente i seguenti componenti: IgG di coniglio purificata per il blocco dei recettori Fc nelle cellule di topo, CD71 FETR one 19 PE e un anticorpo diretto contro la proteina di superficie cellulare fast. Mescolare delicatamente la soluzione di anticorpi capovolgendo il tubo da due a tre volte, aggiungere 200 microlitri della miscela preliminare di anticorpi primari al campione di cellule di fegato fetale precedentemente preparato e pipettare delicatamente su e giù per risospendere le cellule.

Successivamente, preparare questi sei campioni di controllo cellulari. Un campione non colorato in cui le cellule vengono lasciate nel buffer di colorazione per fornire la fluorescenza autofluorescente di fondo delle cellule, un colore singolo per ciascun anticorpo o colorante utilizzato nel protocollo per correggere l'overlap spettrale tra i canali, che in questo esperimento sono TUR one 19 PE CD 71 fz fast, biotina e streptavidina A PC e sette A A DA, e un controllo fluorescence minus one per fast biotina, che fornisce il vero fondo per quel canale in cui le cellule vengono colorate con tutti i coloranti o anticorpi del protocollo tranne fast biotina. Incubare il campione e i controlli pertinenti con il colorante dell'anticorpo primario sul ghiaccio per 45 minuti fino a un'ora al buio.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule aggiungendo tre millilitri di buffer di marcatura a ciascuna provetta e centrifugare per tre-cinque minuti a circa 400 ×g a quattro gradi Celsius. Successivamente, applicare lo streptavidina PC e incubare le provette sul ghiaccio per 30-45 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule come nel caso della colorazione con il primo anticorpo.

Infine, risospendere le cellule in soluzione di marcatura contenente il colorante impermeabile per le cellule e specifico per il DNA seven a a d, al fine di escludere le cellule morte. I campioni sono ora pronti per l'analisi mediante citometria a flusso. L'aspetto più complesso di questa procedura è l'analisi corretta del gating degli eventi citofluorimetrici, che consente l'identificazione affidabile dei sottoinsiemi di eritroblasti.

Richiede un'attenta configurazione dello strumento con tutti i controlli appropriati, una precisa compensazione della sovrapposizione spettrale e un successivo gating che escluda le cellule morte, gli aggregati e gli eventi molto piccoli. All'inizio dell'analisi dei dati, il campione non colorato e i campioni di controllo monocromatici vengono utilizzati per impostare la compensazione della sovrapposizione spettrale per ogni combinazione di colori.

In questo esempio, mostreremo come la fluorescenza di fit e si riversi nel canale PE e come questo sovrapposizione spettrale venga corretta dopo la compensazione. Innanzitutto, utilizzando il controllo non colorato, definiamo una regione positiva per fit E e negativa per PE. Successivamente, utilizzando il controllo monocromatico di fit E, possiamo visualizzare il riversamento spettrale nel canale PE.

Dopo la compensazione digitale con il software FlowJo, il segnale di fuoriuscita E nel canale PE viene minimizzato. Una volta compensate, le cellule morte, gli aggregati e gli eventi di piccole dimensioni possono essere rimossi. Gli aggregati e le cellule doppiette vengono eliminati tracciando l'altezza della diffusione anteriore rispetto all'area della diffusione anteriore e selezionando gli eventi all'interno di una finestra diagonale stretta.

Le cellule morte vengono eliminate selezionando le cellule negative per DAPI, un colorante per il DNA impermeabile alle cellule vive. Il gate per le cellule vitalI negative al DAPI esclude anche eventi molto piccoli, come nuclei o detriti, che presentano una bassissima diffusione in avanti. Successivamente, illustreremo la strategia di gating per le cellule del fegato fetale.

Le cellule appena raccolte sono state marcate per CD71 TUR-uno-19 e per un cocktail di anticorpi marcati con ZI diretti contro marcatori di linea non eritroidi. In questo esempio, i campioni sono già stati compensati per l'overlap spettrale e quindi selezionati per escludere aggregati, cellule morte ed eventi molto piccoli. Utilizziamo il campione FMO, che contiene tutti i coloranti tranne il marcatore fluorocromatico positivo per la linea, per tracciare un istogramma fluorocromatico e definire la finestra delle cellule negative per la linea; successivamente applichiamo questa finestra al campione di cellule del fegato fetale marcate con marcatori di linea coniugati a ZI.

Le cellule negative per la linea sono selezionate e riportate in grafico con CD71 sull'asse Y e TER19. Sull'asse A, le cellule sono ora pronte per essere suddivise in sottogruppi da S0 a S5. Il sottogruppo S0, privo di marcatori di linea (Lin depleted), contiene prevalentemente cellule con potenziale CFUE prima dell'insorgenza della dipendenza da EPO.

Il sottoinsieme S1 contiene cellule CFU-E dipendenti dall'EPO, prevalentemente in fase S del ciclo cellulare. Le cellule del sottoinsieme S2 hanno perso il potenziale di formazione di colonie ed hanno iniziato ad esprimere emoglobina. Le cellule del sottoinsieme S3 sono prevalentemente eritroblasti basofili. I sottoinsiemi S4 ed S5 contengono eritroblasti tardivi. Qui viene mostrata la strategia di analisi successiva all'acquisizione dei dati da cellule spleniche processate e marcate con anticorpi diretti contro CD71 e TER-119, nonché l'istogramma del recettore della morte FAST.

Uno mostra tutti gli eventi acquisiti in cui la porta diagonale rappresenta eventi che probabilmente sono cellule singole, escludendo doppietti o aggregati più grandi. Le cellule all'interno di questa porta vengono analizzate ulteriormente nell'istogramma due qui mostrato. Eventi molto piccoli, probabilmente nuclei o detriti, sono esclusi.

Le cellule selezionate sono mostrate nell'istogramma tre, in cui le cellule positive per DAPI, che probabilmente sono cellule apoptotiche con membrana permeabile, sono escluse dall'ulteriore analisi. L'istogramma quattro mostra la popolazione risultante di cellule vitali della milza. Il pro eGate contiene cellule CD71 ad alto livello e TER119 a livello intermedio; le cellule R119 ad alto livello vengono ulteriormente analizzate nell'istogramma cinque.

Qui, le cellule CD71 ad alto livello vengono suddivise in eritroblasti di area più grande, meno maturi, e in eritroblasti A B più piccoli e più maturi. Il sottoinsieme di eritroblasti più maturo è ARI C. L'espressione di proteine di superficie cellulare può essere misurata contemporaneamente per ciascuno di questi sottoinsiemi aggiungendo le rispettive anticorpi nello stesso momento di TER R one 19 e CD71. L'istogramma di colorazione sei mostra l'espressione di superficie cellulare del recettore della morte fast, specificamente nel sottoinsieme A, in topi allo stato basale e in topi iniettati con una singola dose di E ppo.

I risultati indicano che l'EPO sopprime l'espressione rapida nella zona. Può essere inoltre misurata l'espressione in vivo di proteine intracellulari o lo stato del ciclo cellulare per le cellule in ciascun sottoinsieme. In questa analisi rappresentativa del ciclo cellulare, i topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con BRDU e il midollo osseo è stato prelevato da 30 a 60 minuti dopo.

Oltre ad essere state colorate per CD71 e TER19, le cellule sono state colorate per l'incorporazione di BrdU nel loro DNA; le cellule positive per BrdU si trovano nella fase S del ciclo. Le cellule in interfase sono negative per BrdU e possono essere risolte nelle fasi G1 o G2/M. Utilizzando il DNAD7, le cellule AA D possono essere separate da ciascuno dei sottoinsiemi PRO-E, area AAB e AEC.

Qui sono mostrati in preparazioni di citosine che mostrano una maturazione sequenziale con riduzione della dimensione cellulare, condensazione nucleare e intensificazione della colorazione bruna, che riflette l'espressione di emoglobina. Infine, viene mostrata qui un'analisi rappresentativa del ciclo cellulare del sottoinsieme S3 nel fegato fetale di E 13,5. Topi gravidi sono stati iniettati con BRDU.

I fegati fetali sono stati prelevati da 30 a 60 minuti dopo, fissati, resi permeabili e colorati con anticorpi contro CD71, TER119 e BrdU. Lo stato del ciclo cellulare delle cellule S3 viene analizzato identificando le cellule in fase S, positive per BrdU, e il contenuto di DNA viene quantificato mediante colorazione con il colorante per il DNA 7-AAD.

L'approccio citometrico che descriviamo consente l'indagine simultanea di funzioni cellulari come l'espressione di marcatori della superficie cellulare e di altre proteine, la sopravvivenza cellulare, la trasduzione del segnale mediante anticorpi specifici per fosfo-proteine e lo stato del ciclo cellulare. Ci permette quindi di studiare le risposte molecolari degli eritroblasti, a diversi stadi di maturazione, a un'ampia gamma di stimoli o all'effetto di mutazioni genetiche. Va notato che i sottogruppi di maturazione analizzati mediante citometria a flusso sono definiti in base all'espressione dei marcatori della superficie cellulare e allo scatter in avanti.

Abbiamo riscontrato che, in generale, le cellule di ciascun sottoinsieme corrispondono a uno stadio eritroblastico morfologico simile in una vasta gamma di modelli murini. Tuttavia, raccomandiamo di verificarlo quando si esamina un nuovo modello murino. Separando le cellule di ciascun sottoinsieme ed esaminandone la morfologia, le cellule di ciascun sottoinsieme possono anche essere separate per analisi dell'RNA o del trascrittoma; negli esperimenti di separazione, utilizzare basse pressioni di separazione e ugelli larghi per minimizzare lo stress di taglio sulle cellule.

Si consiglia inoltre di verificare la purezza e la vitalità delle cellule al termine di ogni esperimento di sorting. Infine, quando si rileva un cambiamento nella frequenza di un determinato sottoinsieme, è importante stabilire se questo dipenda da un effettivo cambiamento nel numero di cellule di quel sottoinsieme o se sia dovuto a variazioni in altri sottoinsiemi. Pertanto, oltre a misurare le frequenze dei sottoinsiemi, è sempre necessario determinare anche il numero assoluto di cellule in ciascun sottoinsieme.