Analisi mosaico della funzione del gene nello sviluppo postnatale cervello di topo mediante virus basati su ricombinazione Cre
1 agosto 2011
Un In vivo per testare la funzione del gene nel cervello postnatale è descritto. AAVs ricombinanti che esprimono Cre e / o di una proteina fluorescente vengono iniettate nel cervello di topo neonatale. L'inattivazione del gene mosaico e rada etichettatura neuronali siano raggiunti, consentono una rapida analisi della funzione del gene nei processi critici per lo sviluppo del circuito neurale.
L'obiettivo generale di questa procedura è manipolare la funzione genica durante il periodo postnatale dello sviluppo cerebrale. Questo viene ottenuto innanzitutto selezionando e preparando i virus appropriati, caricandoli nella siringa e predisponendo l'equipaggiamento per l'iniezione. Successivamente, il virus viene iniettato nei cervelli di topolini neonati e l'ultimo passaggio consiste nell'eutanasia degli animali e nell'acquisizione di immagini delle regioni iniettate.
In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano un'etichettatura differenziale di cellule di controllo e cellule knockout mediante microscopia a fluorescenza immunologica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, ad esempio in che modo il periodo dello sviluppo postnatale è regolato geneticamente. Per l'iniezione, si può utilizzare una soluzione virale adeno-associata disponibile in commercio ad alto titolo, tipicamente 10 alla 12a copia genomica per millilitro, al fine di manipolare un elevato numero di cellule.
Se si desidera una diluizione scarsa o un'etichettatura, iniziare con una diluizione da uno a dieci. Dopo aver scongelato il virus su ghiaccio, trasferire immediatamente il volume della pre-diluizione in una provetta PCR sterile da 250 microlitri. Mantenere la diluizione sul ghiaccio. Ora.
Preparare la pompa di iniezione selezionando una siringa adeguata e collegandola a un ago di carico. Successivamente, aspirare delicatamente la soluzione virale finché non si osserva una piccola bolla d'aria nella siringa; può essere utilizzato un colorante inerte per agevolare questo passaggio. A questo punto, fissare saldamente la siringa alla pompa con un fermo.
Quindi collegare delicatamente il tubo di collegamento tra la siringa e il supporto dell'ago. Assicurarsi che l'ago per iniezione sia a diretto contatto con il tubo di collegamento all'interno del supporto dell'ago. Ora, spostare lentamente la soluzione attraverso il tubo di collegamento finché non si forma una piccola goccia di soluzione visibile alla punta dell'ago.
Fissare con attenzione lo stantuffo accanto al blocco spingente mediante un supporto sulla pompa. Impostare la velocità di iniezione a otto microlitri al minuto e il volume di iniezione tra uno e due microlitri. Regolare quindi l'impostazione del diametro della siringa della pompa in modo che corrisponda al diametro della siringa in uso.
Infine, per proteggere i cuccioli durante la fase di recupero, impostare la piastra riscaldata a 38 gradi Celsius e coprirla con un tovagliolo di carta. Utilizzando un protocollo approvato dal comitato IACUC, preparare i cuccioli di topo P zero o P uno per l'iniezione sottoponendoli ad anestesia fredda. Inumidire alcuni tovaglioli di carta con acqua e posizionarli sul ghiaccio.
Quindi posizionare quattro o cinque cuccioli su un asciugamano di carta ben distanziati. Piegate delicatamente l'asciugamano di carta sui cuccioli, ponete una piccola quantità di ghiaccio tritato sopra l'asciugamano e incubate i cuccioli per circa cinque minuti. I cuccioli possono essere mantenuti in sicurezza sul ghiaccio fino a 15 minuti e comunque riprendersi bene.
Ora posizionare un cucciolo anestetizzato su un blocco di montaggio per accedere al meglio al sito di iniezione. Ad esempio, la corteccia è più facilmente accessibile posizionando l'animale disteso sul ventre. Il cucciolo può essere fissato in posizione utilizzando un cerotto, stabilizzando manualmente la testa del cucciolo e tirando la pelle in tensione per evitarne il movimento.
Quindi individuare i punti di riferimento anatomici del cranio, come la sutura lambda, e selezionare con l'altra mano un punto di iniezione riproducibile; inserire delicatamente l'ago attraverso il cranio. Non esercitare pressione eccessiva se l'ago non penetra facilmente nel cranio. Invece, riposizionare l'ago e tentare nuovamente con delicatezza.
La profondità di iniezione varia leggermente tra animali e ceppi individuali; per la corteccia, di solito è efficace una profondità compresa tra mezzo e un millimetro. Ora, iniettare la soluzione virale facendo attivare la pompa da un collega per minimizzare i movimenti della mano. Idealmente, si potrebbe utilizzare un pedale per attivare la pompa dopo l'iniezione.
Mantenere l'ago in posizione per alcuni secondi, quindi estrarlo con movimento fluido mantenendo immobile la testa del cucciolo. Ora, lasciare che il cucciolo si riprenda per cinque-dieci minuti su una piastra riscaldata coperta.
Nel frattempo, continuare a iniettare gli altri cuccioli. Quando tutti i cuccioli hanno ripreso il colore rosa e si stanno muovendo, massaggiarli delicatamente con una parte della loro lettiera originale. Solo a quel punto possono essere restituiti alla madre.
In caso contrario, potrebbero essere trattati come cuccioli sconosciuti, che la madre molto probabilmente ucciderebbe dopo che i cuccioli le sono stati restituiti. Pulire il sistema di iniezione caricando completamente la siringa con acetone o etanolo al 70%. Se sono presenti componenti sensibili all'acetone, come sano, acurate o adesivi, passare la soluzione attraverso il sistema di iniezione diverse volte utilizzando ogni volta soluzione fresca.
Questo rimuoverà qualsiasi soluzione virale residua e i solventi precipitati evaporeranno. Dopo aver lavato il sistema, disinfettare l'area di lavoro con la candeggina per lasciarla pronta per il prossimo sperimentatore. Mentor. Una tecnica eseguita con successo produce un'infezione neuronale robusta nel sito di iniezione.
Le iniezioni in regioni specifiche, come la corteccia e il collicolo superiore, generano tipicamente infezioni localizzate con una diffusione minima alle aree adiacenti. L'uso di una soluzione virale ad alto titolo rende più probabile l'infezione di aree adiacenti come l'ippocampo, rispetto a un'iniezione con soluzione virale a basso titolo. I risultati mostrano un'infezione scarsa, tipicamente vicino al sito di iniezione; ad esempio, l'iniezione nel cervelletto lungo la linea mediana. Il numero di cellule infette dovrebbe correlare con il titolo della soluzione virale iniettata.
Ad esempio, l'iniezione di una miscela di soluzioni ad alto titolo di due virus AAV8 che esprimono diverse proteine fluorescenti nel cervelletto infetta numerose cellule kinji etichettate in modo differenziale. Al contrario, l'iniezione di una soluzione virale a basso titolo può determinare un'infezione scarsa, utile per la visualizzazione di singole cellule. I neuroni marcati con fluorescenza possono essere osservati direttamente in tessuto fresco appena tagliato e vitale, oppure possono essere sottoposti a immunomarcatura.
Questo potenzia i segnali fluorescenti endogeni per la successiva acquisizione delle immagini mediante microscopia fluorescente a campo ampio o confocale. Infine, il RAAV otto è in grado di infettare diversi tipi di neuroni nella corteccia, con un'etichettatura intensa dei processi fini. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 30 minuti se effettuata correttamente.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo in vivo per testare la funzione genica durante lo sviluppo cerebrale postnatale utilizzando AAV ricombinanti. Iniettando questi virus nei cervelli di topi neonati, i ricercatori possono ottenere un'inattivazione genica a mosaico e una marcatura neuronale scarsa, facilitando l'analisi della funzione genica nello sviluppo dei circuiti neurali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Funzione genica
- Sviluppo dei circuiti neurali
Sfondo
- Comprendere la funzione genica durante lo sviluppo cerebrale postnatale è fondamentale.
- I virus adeno-associati ricombinanti possono essere utilizzati per manipolare l'espressione genica.
- Questo metodo consente lo studio della regolazione genetica durante i periodi critici dello sviluppo.
- La microscopia a immunofluorescenza può distinguere tra cellule di controllo e cellule knockout.
Scopo dello studio
- Manipolare la funzione genica nel periodo postnatale dello sviluppo cerebrale.
- Indagare come i fattori genetici regolino lo sviluppo neuronale postnatale.
- Fornire informazioni sui meccanismi alla base della formazione dei circuiti neurali.
Metodi Utilizzati
- Selezione e preparazione di AAV ricombinanti appropriati.
- Iniezione di virus nei cervelli di topi neonati.
- Microscopia a immunofluorescenza per l'immagine delle regioni iniettate.
- Analisi dell'etichettatura differenziale di cellule controllo e cellule knockout.
Risultati principali
- Inattivazione genica ed etichettatura neuronale riuscite.
- I risultati dimostrano la regolazione genetica dello sviluppo postnatale.
- Il metodo fornisce un quadro di riferimento per future ricerche in neuroscienze.
- Le conoscenze acquisite possono contribuire alla comprensione della dinamica dei circuiti neurali.
Conclusioni
- Questo metodo è efficace per lo studio della funzione genica nel cervello in via di sviluppo.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dello sviluppo dei circuiti neurali.
- La ricerca futura può basarsi su questo approccio per esplorare l'influenza genetica sul comportamento.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Questo metodo consente un'analisi rapida e scalabile della funzione genica nello sviluppo cerebrale postnatale, affrontando una lacuna critica nella validazione degli obiettivi terapeutici per i disturbi dello sviluppo neurologico. Evitando i limiti legati alla letalità embrionale, supporta la riduzione del rischio meccanicistico di bersagli terapeutici in vie metaboliche rilevanti per l'autismo e la schizofrenia. L'approccio fornisce una sicurezza predittiva nella selezione dei bersagli, collegando la perturbazione genetica a fenotipi a livello di circuito in un sistema fisiologicamente rilevante.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi della funzione genica in circuiti neurali postnatali, dove molti geni associati a disturbi dello sviluppo neurologico esercitano i loro effetti.
- Valore operativo: Permette l'inattivazione mosaicica dei geni e una marcatura sparsa in pochi giorni, evitando la generazione di modelli murini condizionali che richiede mesi.
- Valore scientifico: Favorisce l'analisi funzionale cellulare autonoma di geni coinvolti nella crescita assonale, nel tiling dendritico e nel perfezionamento delle sinapsi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera popolazioni cellulari di controllo e knockout quantitativamente confrontabili mediante etichettatura fluorescente differenziale per la valutazione comparativa dei fenotipi.
- Valore operativo: Consente la titolazione del titolo virale per modulare la densità di infezione, permettendo un'etichettatura scalabile, fitta o rada, in base alle esigenze dei saggi successivi.
- Valore scientifico: Compatibile con letture mediante immunofluorescenza ed elettrofisiologia, facilitando la validazione multimodale dell'interazione con il bersaglio e dell'impatto sui circuiti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Modella la perturbazione genetica postnatale in topi e ratti, allineandosi al tempo di sviluppo dell'insorgenza dei disturbi neuropsichiatrici umani.
- Valore operativo: Si estende alla somministrazione lentivirale e a costrutti di shRNA o di dominante negativo, ampliando il toolkit per la modulazione degli obiettivi nella validazione preclinica.
- Valore scientifico: Consente lo studio della funzione genica in processi critici come la formazione delle sinapsi, direttamente rilevante per i meccanismi fisiopatologici dei disturbi psichiatrici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta, supportando la validazione del bersaglio e l'identificazione di composti promettenti fornendo evidenze genetiche causali nei circuiti neurali postnatali prima dello screening dei composti.
- Biologia della scoperta: Verifica ipotesi terapeutiche eliminando geni candidati in regioni cerebrali definite per valutarne le conseguenze fenotipiche sulla maturazione dei circuiti neurali.
- Screening: Produce preparazioni neuronali standardizzate e riproducibili con controlli interni (cellule marcate rispetto a non marcate) per una misurazione affidabile degli effetti dei composti.
- Analisi: Genera dati quantitativi di imaging ed elettrofisiologia che consentono il confronto statistico tra genotipi e condizioni di trattamento.
- Ricerca traslazionale: Collega la manipolazione genetica a risultati a livello di circuito, supportando la validazione preclinica allineata ai biomarcatori della modulazione del bersaglio.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile di somministrazione virale applicabile a diversi bersagli genici e regioni cerebrali, riducendo lo sviluppo ridondante di modelli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio collegando la perdita genica postnatale a fenotipi circuitali specifici.
- Valore operativo: Standardizza la perturbazione genica mediante somministrazione virale, migliorando la riproducibilità tra laboratori e studi.
- Valore strategico: Accelera le decisioni di avanzamento o abbandono del progetto stabilendo rapidamente la causalità genetica in finestre postnatali rilevanti per la malattia.
- Impatto sul portafoglio: Riduce i rischi nell' avanzamento del bersaglio fornendo evidenze funzionali in sistemi che modellano i tempi dello sviluppo neurologico umano.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di topi neonati, nell'iniezione stereotassica e nelle procedure di biosicurezza virale.
- È subordinato all'accesso a vettori virali ricombinanti AAV o lentivirali purificati e a infrastrutture per microscopia a fluorescenza.
- Necessita della standardizzazione del titolo virale, del volume di iniezione e delle procedure anestesiologiche per garantire coerenza tra studi.
- L'adattamento a diverse regioni cerebrali o specie potrebbe richiedere un'ottimizzazione delle coordinate di iniezione e del tropismo del sierotipo virale.
- Limite pratico: l'efficacia dipende dall'efficienza della ricombinasi Cre e dalla disponibilità di alleli floxed, che può variare in base alle sequenze bersaglio.
