ReAsH / Flash Etichettatura e Image Analysis di proteine ​​sensore Tetracysteine ​​nelle celle

L'obiettivo generale di questa procedura è etichettare le cellule che esprimono una proteina con un'etichetta tetra-cisteina e fluorescente utilizzando i coloranti flash o ash, e analizzare quantitativamente i risultati. Ciò si ottiene innanzitutto trasfettando un plasmide portatore di una proteina fluorescente e della proteina bersaglio contenente un'etichetta tetra-cisteina nella linea cellulare di interesse. Successivamente, la proteina espressa viene etichettata con R o flash, e il colorante legato in modo non specifico viene rimosso mediante lavaggio con BAL, pronta per l'analisi microscopica.

Quindi si utilizza un microscopio confocale per acquisire immagini fluorescenti delle cellule nei canali ash o flash e della proteina fluorescente. Infine, le immagini vengono analizzate mediante ImageJ per quantificare il legame di ash o flash alla proteina bersaglio. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano il grado di legame di ash o flash alla proteina bersaglio nelle cellule, attraverso la correlazione tra la fluorescenza di ash e quella della proteina fluorescente.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'utilizzo semplice della proteina bersaglio con GFP, è che permette di tracciare una seconda proprietà della proteina, come ad esempio un cambiamento conformazionale, oltre alla sua localizzazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della substruttura e della funzione proteica, come gli eventi di localizzazione, i cambiamenti conformazionali e gli eventi di legame con LI che alterano la capacità del TAC di legarsi o dissocarsi. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando volevamo valutare come si formassero nelle cellule piccole polimerizzazioni submicroscopiche della proteina huntingtina.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi di analisi dei dati sono difficili da apprendere a causa della loro complessità tecnica. I passaggi da uno a tre saranno eseguiti da Yasmin Ranson, assistente di ricerca del nostro laboratorio, che illustrerà l'analisi dei dati. Il passaggio quattro sarà eseguito da Sevki GaN, studente laureato del nostro laboratorio, utilizzando metodi standard di coltura cellulare per la linea cellulare di interesse e una piastra per imaging di cellule vive pronta per la trasfezione.

Preparare una coltura di cellule aderenti e trasfettare il plasmide contenente il gene di interesse con il tag TC. In base al metodo di trasfezione scelto, è importante includere controlli positivi e negativi al fine di valutare l'entità del legame specifico ai tag TC, nonché verificare la fuoriuscita di fluorescenza tra canali durante l'acquisizione di micrografie confocali. Pertanto, per due colori, assicurarsi che i campioni siano preparati per ciascun colore singolarmente, sia per la proteina fluorescente da sola, sia, se possibile, per una proteina T ctech legata a flesh o vs.

Ma senza una proteina fluorescente. Uno o due giorni dopo la trasfezione, risciacquare delicatamente le cellule con 300 microlitri di soluzione salina equilibrata di Hank pre-riscaldata o HBSS, preparare fresca HBSS pre-riscaldata con 10 micromolari di etanoditiolo o EDT e 1 micromolare di flash o ash. Dopo aver rimosso l'HBSS dalle cellule, sostituirla delicatamente con 300 microlitri del mezzo ash e incubare per esattamente 30 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari.

Nella nostra esperienza, tempi di incubazione più lunghi aumentano significativamente la fluorescenza di fondo. Aspirare delicatamente la soluzione di marcatura dalle cellule e sostituirla con 300 microlitri di HBSS preriscaldato con 250 micromolare, due tre dimer, cap propanolo o BAL per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere la soluzione di lavaggio mediante aspirazione delicata e sostituirla con 300 microlitri di HBSS preriscaldato.

Dopo questo lavaggio, le cellule possono essere fissate con paraformaldeide, anche se abbiamo osservato che ciò aumenta la fluorescenza aspecifica. Pertanto, di solito osserviamo le cellule vive a temperatura ambiente. Inoltre, la fissazione delle cellule prima dell'etichettatura impedisce il legame del colorante bivalente.

Per iniziare l'acquisizione delle immagini delle cellule al microscopio confocale, impostare i parametri per l'immagine dei singoli fluorofori e assicurarsi che non vi sia un passaggio trascurabile di segnale tra i canali. Successivamente, regolare le impostazioni del fotomoltiplicatore in modo che la massima fluorescenza nel campione non saturi il rilevatore. Una volta determinate le migliori condizioni di acquisizione, non modificare alcuna di queste impostazioni tra un campione e l'altro.

Utilizzare una velocità di scansione di 200 hertz, acquisire quattro medie di linea e impostare il diametro del pinhole a un'unità di area. Il diametro del pinhole può essere aumentato se si verificano problemi di rapporto segnale-rumore. Tuttavia, ciò potrebbe comportare una certa perdita di risoluzione nell'immagine.

Acquisire le immagini confocali in un formato a 12 bit o superiore, se possibile. Per massimizzare la qualità dell'analisi quantitativa dei dati. Acquisire immagini per il canale della proteina fluorescente e anche per il canale del colorante BI arsenal per tutti i campioni.

Per analizzare i dati, utilizzare il software Image J con i seguenti plugin. Se si utilizza una versione di Image J precedente alla versione 1.32 C, fare clic sulle seguenti opzioni. Per abilitare l'apertura contemporanea di più immagini, modificare le opzioni di input / output, selezionare la casella per utilizzare il selettore file j per aprire / condividere.

Fare clic su OK. Aprire le immagini di interesse. Image J definirà automaticamente le intensità massime e minime dei pixel visualizzate sullo schermo per ciascuna immagine separatamente, poiché immagini diverse avranno intensità dei pixel differenti.

Ciò significa che le immagini visualizzate non sono direttamente confrontabili. Per garantire che le immagini aperte siano tutte alla stessa scala, definire fisicamente le intensità minima e massima dei pixel da visualizzare. Per impostare questi valori, selezionare l'immagine e regolare il contrasto/luminosità.

Fare clic su "imposta", definire i valori minimi e massimi da visualizzare. Quindi scegliere "propaga a tutte le immagini aperte" e fare clic su "ok". In alternativa, posizionare tutte le immagini relative a un determinato canale in un singolo file o stack.

Image J regolerà automaticamente tutte le immagini alla stessa scala. Per eseguire questa operazione, selezionare immagini stack di immagini per creare uno stack, inserire un nome comune a ciascun file e scegliere "utilizza i titoli come etichette". Fare clic su ok.

Convertire tutte le immagini aperte in formato a otto bit per l'analisi. Scegliendo il tipo di immagine a otto bit, l'intervallo visualizzato verrà ridimensionato in un intervallo da zero a 255. È importante non salvare sopra il formato originale a 12 bit o superiore, poiché ciò comporterebbe una perdita di informazioni.

Salvare una copia in una nuova cartella denominata eight bit converted utilizzando l'opzione Salva con nome. Un metodo per esaminare il grado di legame del colorante bi arsal in un'intera immagine è eseguire un grafico di correlazione dell'intensità dei pixel. Questo grafico mostra il valore di ogni pixel in un canale rispetto al valore del pixel corrispondente in un secondo canale.

Pertanto, una posizione di pixel con un'intensa fluorescenza GFP presenterà anche un'intensa fluorescenza della cenere se vi è un elevato legame. Per analizzare la co-correlazione dei pixel, assicurarsi che le immagini REA e GFP a otto bit siano aperte in ImageJ. Successivamente, aprire il plugin Image Correlator selezionando Plugin > Image Correlator. Assegnare i file delle immagini a Immagine uno e Immagine due.

Quindi fare clic su ok. L'insieme risultante potrebbe non mostrare alcuna informazione dettagliata. Questo è normale.

Salvare il pacchetto in una nuova cartella chiamata scatterplots e assegnargli lo stesso nome del file del campione a cui si riferisce. Ad esempio, Ash GFP Correlation plot. Per visualizzare i dati, scegliere una delle due opzioni.

Prima di tutto, trasformare i dati in formato logaritmico selezionando l'opzione elaborazione matematica log automatico. Successivamente, per ridimensionare visivamente i dati, fare clic su immagine regola luminosità/contrasto e selezionare automatico. In secondo luogo, ridimensionare visivamente i dati in modo da mostrare solo i valori bassi e visualizzare i dati utilizzando una tabella di lookup speciale o LUT per creare una LUT personalizzata.

Fare clic su modifica colore immagine LUT per una LUT molto semplice. Fare clic sul pixel in alto a sinistra e scegliere il colore nero. Quindi selezionare il pixel successivo a destra e scegliere il colore rosso.

Successivamente, fare clic sul terzo pixel e, tenendo premuto il pulsante del mouse, trascinare la selezione fino al pixel in basso a destra. Selezionare il colore rosso, fare clic su OK, quindi selezionare il colore bianco e fare clic su OK. Selezionare l'intervallo di luminosità/contrasto da zero a 255 come descritto in precedenza per bloccare l'immagine a quella mostrata sullo schermo.

Convertirlo in formato RGB per copiare e incollare le immagini in altri programmi. Aprire innanzitutto le immagini a otto o 16 bit come descritto in precedenza. Assegnare uno schema cromatico LUT alle immagini per GFP.

Assegnare la LUT verde facendo clic sull'immagine. Selezionare le tabelle di lookup verdi. Infine, scegliere l'immagine da copiare e copiarla negli appunti selezionando modifica copia nel sistema. Questa figura mostra un risultato tipico per la chinasi sock fusa, la GFP e un tag TC che è stato colorato per 30 minuti.

Nelle cellule HEC 2 9 3 con ASH, sembra che ASH si leghi in modo efficiente alla proteina bersaglio recante un marcatore TC con alta affinità. Al contrario, questa figura mostra il campione di controllo corrispondente di SARK fuso a GFP, ma privo del marcatore TC, essenziale per verificare sia la specificità del marcatore TC sia il livello di colorazione di fondo. Questo risultato mostra che RH non presenta reattività con la proteina bersaglio priva del marcatore TC, indicando così la specificità del marcatore TC per il legame con SSH.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di non permettere alle cellule di diventare confluenti e tranquille, poiché ciò influenzerà il legame di V nelle cellule. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come analizzare in modo semplice i propri dati in maniera quantitativa, e si possono perfezionare questi metodi per sviluppare il proprio IUTS unico per la visualizzazione dei dati.