Shape Memory Polymers per la Cultura cella attiva

L'obiettivo generale di questa procedura è coltivare cellule su un substrato con una topografia che cambia nel tempo. Questo risultato si ottiene innanzitutto programmando un polimero a memoria di forma in una forma permanente che può essere "ricordata". Il polimero a memoria di forma viene quindi programmato in una forma temporanea, sulla quale in seguito vengono seminate le cellule.

L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'attivare il polimero a memoria di forma affinché ritorni alla sua forma permanente aumentando la temperatura; i risultati finali possono essere ottenuti mostrando un cambiamento nel comportamento cellulare mediante microscopia a fluorescenza. Ciao, mi chiamo Pat Mather. Sono professore di Ingegneria Biomedica e Chimica e direttore dell'Istituto di Biomateriali di Syracuse qui alla Syracuse University.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad apparecchiature commerciali o su misura per stirare le cellule è che, in un singolo sistema polimerico, siamo in grado di applicare una vasta gamma di deformazioni complesse alle cellule. Mi chiamo Jay Henderson. Sono professore assistente di Ingegneria Biomedica e Chimica e membro del Syracuse Biomaterials Institute.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della meccanobiologia, ad esempio in che modo le cellule rispondono a cambiamenti dinamici del loro ambiente fisico. Mi chiamo Kevin Davis e sono uno studente di dottorato presso la Syracuse University, nel Dipartimento di Ingegneria Biomedica e Ingegneria Chimica. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia meccanica in 2D, può essere utilizzato anche per altri sistemi, come ad esempio impalcature tridimensionali a forma variabile per l'ingegneria dei tessuti.

Prima di iniziare questa procedura, preparare una camera di polimerizzazione personalizzata utilizzando una lamella di vetro, uno spaziatore in teflon dello spessore di un millimetro e una piastra in alluminio. Fissare la camera con piccole graffette metalliche, quindi iniettare l'NOA 63 nella camera attraverso un foro nello spaziatore in teflon utilizzando un ago da 18 gauge. Successivamente, posizionare la camera su una piastra riscaldata impostata a 125 gradi Celsius.

Lasciare che la camera si riscaldi a una temperatura uniforme per cinque minuti dopo il riscaldamento della camera. Polimerizzare il NOA 63 per 20 minuti posizionando una lampada UV a 6,5 centimetri dalla superficie del vetro. Rimuovere il NOA 63 dalla camera mentre è ancora caldo utilizzando una lametta.

Quindi, eseguire una post-polimerizzazione del polimero a memoria di forma sotto luce UV per tre ore e 40 minuti direttamente sulla piastra riscaldata a 125 gradi Celsius. Per caratterizzare la memoria di forma del NOA 63, preparare un provino a forma di otto mediante pressatura a caldo del film polimerizzato utilizzando un punzone personalizzato. Infine, inserire il provino in un analizzatore meccanico dinamico dotato di attacco per prova di trazione.

Impostare lo strumento in modalità controllata per forza e programmare la procedura di prova come indicato nel protocollo scritto allegato a questo video. Il risultato della procedura è un polimero a memoria di forma curato isotermicamente o un film di SMP posizionato CSMP su una piastra riscaldata e impostare la temperatura superiore alla temperatura di transizione vetrosa al fine di ridurre il modulo e facilitare il taglio. Per preparare campioni singoli dal film di s e p curato isotermicamente.

Tagliare il film s e p con un rasoio alla dimensione desiderata del campione. La forma temporanea può essere fissata in diversi modi. Qui viene utilizzata una pressa idraulica da banco con piastre riscaldabili e raffreddabili per creare una topografia temporanea.

Per prima cosa, impostare la temperatura delle PLA a un valore superiore alla tg. Per questa dimostrazione, è stato realizzato un punzone incollandosi un epossidico su un disco in vinile per produrre una forma temporanea di solchi paralleli. Il punzone può essere realizzato con altri materiali e con diverse topografie, ma deve essere più rigido rispetto al NOA 63.

Alle temperatura di goffratura, posizionare i campioni s e p a faccia in giù sul goffratore. Successivamente, inserire i campioni e il goffratore nella pressa. Applicare un precarico di circa 100 chilopascal per stabilire il contatto tra le PLA riscaldanti e i campioni, mantenendo per circa cinque minuti per consentire ai campioni di raggiungere una temperatura uniforme.

Una volta raggiunta una temperatura uniforme, applicare da uno a sei megapascal ai campioni e mantenere per un minuto. Il SMP si fratturerà. Se viene applicato un carico maggiore.

Applicare sollecitazioni minori per introdurre topografie con ampiezze più ridotte. Dopo aver applicato la pressione, ridurre la temperatura al di sotto della TG utilizzando la capacità di raffreddamento ad acqua della pressa plaats. Quando la temperatura è inferiore alla tg, rimuovere la forza applicata prima di iniziare l'esperimento con colture cellulari attive.

La luce UV della cappa a sicurezza biologica viene utilizzata per sterilizzare i campioni. Disporre i campioni a faccia in giù in piastre sterili senza coperchio e accendere la luce UV per sei ore. Successivamente, capovolgere i campioni in nuove piastre sterili posizionandoli a faccia in su.

Accendere la luce UV per ulteriori sei ore. I campioni devono raggiungere uno stato relativamente stabile prima della semina con le cellule. Posizionare i campioni in una piastra a 96 pozzetti e aggiungere 150 microlitri di terreno di crescita completo.

Mezzo per pozzetto. Posizionare la piastra in un incubatore a 30 gradi Celsius con 5%CO2 fino al raggiungimento del parziale recupero desiderato. Per questa dimostrazione, i campioni vengono incubati per 30 ore per produrre un'ampiezza sufficientemente grande da permettere l'allineamento delle cellule.

Dopo aver ottenuto un recupero parziale, i campioni possono essere seminati con cellule. Posizionare i campioni in una nuova piastra a 96 pozzetti. Quindi aggiungere 150 microlitri di soluzione cellulare a ciascuno dei campioni qui, C3 H 10 t e mezzo.

La maggior parte dei fibroblasti embrionali viene utilizzata a una concentrazione di 20.000 cellule per millilitro. Per ottenere cellule isolate, lasciare attaccare e diffondere le cellule sulla topografia temporanea incubando a 30 gradi Celsius per 9,5 ore. Successivamente, analizzare la morfologia cellulare prima della transizione rimuovendo i campioni ed eseguendo la colorazione e l'analisi mediante microscopia a fluorescenza dei campioni.

Questo materiale presenta autofluorescenza nella maggior parte dello spettro UV e visibile; si raccomandano fluorocromi nell'estremità del rosso lontano dello spettro, come Alexa Fluor 647, per ridurre il fondo. Per indurre il recupero dei campioni, spostare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e proseguire la coltura per 19 ore. Questo consente al materiale di recuperare e alle cellule di adattare la loro morfologia alla nuova topografia. Al termine dell'incubazione, applicare i coloranti appropriati, come la falloidina, per l'immagine dell'actina filamentosa.

Come passaggio finale, le cellule possono essere analizzate sulla nuova topografia mostrata qui, che rappresenta la memorizzazione unidirezionale della forma in massa di una singola polimerizzazione di NOA 63. Ripetuto tre volte, dove l'asterisco indica l'inizio sperimentale della polimerizzazione. NOA 63 è un solido trasparente e vetroso che possiede eccellenti proprietà di memoria di forma.

In questo caso, il materiale è stato polimerizzato e presenta una temperatura di transizione vetrosa uniforme di 51,1 gradi Celsius, determinata a partire dall'inizio della diminuzione del modulo di immagazzinamento. La diminuzione della deformazione osservata in questo caso si verifica alla tg misurata. Una percentuale elevata della deformazione applicata del 4,7% è stata fissata dopo lo scarico a 20 gradi Celsius, corrispondente a un rapporto di fissaggio dell'89,3%. La deformazione fissata è stata successivamente recuperata con un rapporto dell'84,4% in un intervallo di temperatura relativamente ridotto durante il riscaldamento.

La prestazione di memoria di forma non ha mostrato deterioramento fino a tre cicli, come dimostrato dal fatto che tutte le curve seguono quasi esattamente lo stesso percorso. L'ampiezza della topografia temporanea diminuisce nel tempo a 30 gradi Celsius entro 30 ore. A 30 gradi Celsius.

L'ampiezza è stata ridotta di circa il 50%, come indicato qui a tempo zero. Si riduce ulteriormente del 10% nelle successive 9,5 ore. Quando il recupero viene innescato aumentando la temperatura a 37 gradi Celsius, l'ampiezza si riduce allo 0,5% dell'ampiezza iniziale entro 9,5 ore per l'embossatore utilizzato e una sollecitazione di stampa a rilievo di 4,9 megapascal.

Questo corrisponde a un cambiamento funzionale da solchi di 13 micrometri a una superficie quasi piatta. Questo polimero recupera nel range di temperatura compreso tra 30 e 37 gradi in condizioni di coltura cellulare. Ciò è dovuto all'assorbimento di acqua dal mezzo di coltura; l'acqua plasticizza il polimero, riducendo così la temperatura di transizione vetrosa (tg), consentendo la ripresa a temperature inferiori alla tg a secco di 51 gradi.

Un esempio di comportamento cellulare controllato attraverso l'uso di substrati attivi per colture cellulari è il cambiamento nell'organizzazione del citoscheletro su substrati provvisoriamente scanalati. Prima che venga innescata la ripresa, i filamenti microscopici di actina si allineano lungo la direzione delle scanalature. Dopo la ripresa, ottenuta aumentando la temperatura, i microfilamenti si sono riorganizzati e risultano orientati in modo casuale.

Al contrario, i campioni di controllo con geometrie statiche, piatte o con scanalature statiche non si riorganizzano dopo un aumento della temperatura. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che la geometria della camera di polimerizzazione, la temperatura di transizione del polimero, il metodo di fissaggio della deformazione e la composizione del polimero stesso possono essere tutti modificati per ottenere la transizione desiderata nel proprio esperimento seguendo questa procedura. Altri metodi, come la PCR in tempo reale, possono essere utilizzati per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio come l'espressione genica cambia in risposta alla stimolazione meccanica fornita dal substrato dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della meccanobiologia cellulare per studiare il citoscheletro cellulare, il riarrangiamento e la fisica della materia morbida in due dimensioni. Grazie per l'interesse dimostrato per il nostro lavoro e per aver guardato.