Tridimensionale pelle umana Ricostruire Modello: uno strumento per studiare la pelle normale e progressione Melanoma

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un ricostrutto cutaneo umano tridimensionale per studi sulla biologia dei melanociti, del melanoma e delle cellule staminali della pelle. Questo viene ottenuto innanzitutto rivestendo un inserto di piastre per colture cellulari con collagene bovino neutralizzato. Il secondo passaggio consiste nel creare il compartimento dermico cellulare a partire da fibroblasti e collagene.

Successivamente, preparare il compartimento epidermico a partire da cheratinociti mescolati con melanociti o cellule di melanoma. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel prelevare un costrutto cutaneo al giorno 18 e nel trapiantare il costrutto cutaneo su un topo. Infine, analisi immunohistochimiche e immunofluorescenti del trapianto mostrano l'architettura della cute normale contenente melanociti, la migrazione e la differenziazione di cellule staminali normali e fenotipi specifici del melanoma in stadi particolari.

Abbiamo sviluppato il modello di ricostruzione cutanea 20 anni fa perché fin dall'inizio dei nostri studi abbiamo osservato che melanociti normali o cellule di melanoma coltivate in una piastra si comportano in modo molto diverso rispetto alle cellule presenti in un contesto tissutale. Pertanto, il modello di ricostruzione cutanea è ideale per osservare come le cellule si spostino da un compartimento della pelle a un altro. La miscela di collagene acellulare precedentemente preparata viene tenuta sul ghiaccio e quindi un millilitro della soluzione giallo paglierino viene aggiunto in ciascun inserto di una piastra a sei pozzetti.

Incubare il vassoio per colture cellulari in una piastra a pozzetti per 30 minuti a temperatura ambiente, in modo da permettere al gel di solidificare. Durante questo periodo, la soluzione dovrebbe cambiare colore da giallo a rosa mentre il gel si solidifica. Trattare le cellule di fibroblasto umano con tripsina, prelevandole dal loro fiasco di coltura mediante 0,25% tripsina-EDTA dopo cinque minuti. Aggiungere DMEM contenente il 10% di FBS per neutralizzare il processo di dissezione.

Raccogliere le cellule staccate mediante centrifugazione per cinque minuti a 200 ×g a temperatura ambiente, quindi risospendere le cellule a 4,5 volte 10 alla quinta cellule per 1,5 millilitri di DMEM integrato con 10% FBS. Successivamente, riempire una provetta da 50 millilitri con la miscela di collagene e strato cellulare precedentemente preparata e porre la provetta sul ghiaccio.

Aggiungere 1,5 millilitri della sospensione di fibroblasti al tubo e mescolare accuratamente. Aggiungere tre millilitri della soluzione dello strato cellulare giallo paglierino in ciascun inserto rivestito con strato acellulare. Quindi incubare il vassoio per colture tessutali per 45 minuti a 37 gradi Celsius in un'incubatrice per colture cellulari con 5% di anidride carbonica durante il periodo di incubazione.

Il colore della soluzione dello strato cellulare dovrebbe inoltre cambiare dal giallo al rosa. Una volta che il gel dello strato superiore si è solidificato, aggiungere due millilitri di DMEM contenente il 10% di FBS all'interno dell'inserto nella piastra per colture tessutali e 10 millilitri all'esterno dell'inserto. Incubare le piastre per colture tessutali per quattro giorni.

Il quarto giorno verificare che il gel si sia contratto: aspirare il mezzo sia dall'interno che dall'esterno di ogni inserto. Aggiungere due millilitri di mezzo di lavaggio all'interno e 10 millilitri all'esterno degli inserti per rimuovere il siero normale. Quindi incubare le piastre per un'ora a 37 gradi Celsius per la generazione dell'epidermide.

Prima si tratta con tripsina i cheratinociti umani. Dopo cinque minuti, si utilizza l'inibitore della tripsina da soia per neutralizzare la tripsina, dopo aver centrifugato le cellule staccate a 200 G per cinque minuti. Successivamente, si risospende il pellet cellulare a una concentrazione di 4,17 × 10⁶ cellule per millilitro nella cute.

Ricostruire il mezzo dopo aver raccolto i cheratinociti. Incubare i melanociti umani con tripsina ghiacciata per uno o due minuti. Nuovamente, neutralizzare la tripsina con l'inibitore della tripsina della soia.

Quindi, dopo aver centrifugato le cellule nelle stesse condizioni di prima, risospendere il pellet di melanociti a 8,3 × 10⁵ cellule per millilitro in mezzo di ricostruzione cutanea uno. Successivamente, rimuovere il mezzo di lavaggio sia dall'interno che dall'esterno di ogni inserto di un vassoio per colture tessutali con strato dermico preparato.

Sostituire il mezzo di lavaggio aggiungendo 1,5 millilitri di mezzo per ricostrutto cutaneo, uno all'interno e 10 millilitri all'esterno di ogni inserto. Quindi mescolare 600 microlitri della sospensione cellulare di cheratinociti con 600 microlitri della sospensione di melanociti. Distribuire 200 microlitri della sospensione cellulare mista.

Goccia a goccia all'interno di ogni inserto. Incubare il vassoio per colture cellulari per due giorni a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione delle cellule, aspirare il mezzo di ricostruzione cutaneo sia dall'interno che dall'esterno di ogni inserto, quindi aggiungere due millilitri di mezzo di ricostruzione cutaneo all'interno e dieci millilitri all'esterno dell'inserto.

Quindi incubare i ricostrutti per altri due giorni a 37 gradi celsius. Dopo la seconda incubazione di due giorni, aspirare il mezzo per ricostruzione della pelle, mezzo due, sia dall'interno che dall'esterno di ogni inserto. Aggiungere ora 7,5 millilitri del mezzo per ricostruzione della pelle, mezzo tre, soltanto all'esterno degli inserti.

Rimettere i ricostrutti nell'incubatore e cambiare la cute. Cambiare il mezzo di ricostruzione ogni due giorni fino al giorno 18. Al giorno 18 dell'incubazione, aspirare il mezzo dall'interno e dall'esterno degli inserti di un vassoio per colture cellulari con tessuto ricostruito della pelle.

Rimuovere gli inserti dal vassoio con pinze. Ritagliare la costruzione inclusivo del filtro in policarbonato, tracciando un cerchio vicino al bordo con una lama da bisturi. Quindi posizionare la ricostruzione sul filtro su una superficie rigida e tagliarla a metà con la lama.

Posizionare una metà del ricostrutto su un foglio di carta per biopsia TBS nera, quindi inserire il foglio in una cassetta per istologia. Immergere l'intera cassetta in formalina al 10% per più di quattro ore. Successivamente, posizionare la cassetta in etanolo al 70% e conservarla a quattro gradi Celsius fino al momento dell'elaborazione del ricostrutto per l'inclusione in paraffina.

Posizionare l'altra metà del ricostrutto in saccarosio al 50% a quattro gradi Celsius per uno o due ore. Successivamente, sostituire il saccarosio con una soluzione due molare e conservare a quattro gradi Celsius per altre una o due ore. Riempire parzialmente uno stampo di base con il mezzo di congelamento OCT (optimal cutting temperature).

Evitare la formazione di bolle. Afferrare il bordo del ricostrutto con pinzette e rimuoverlo dal saccarosio. Posizionarlo su salviette Kim fino a quando il saccarosio non viene assorbito.

Utilizzando pinze e una spatola, trasferire il costrutto nell'imbarcazione sopra l'OCT. Coprire la parte superiore del costrutto con ulteriore OCT finché l'imbarcazione non sarà completamente piena. Ancora una volta, evitando bolle.

Posizionare la barchetta uniformemente su anidride carbonica solida tritata per consentire al OCT di congelarsi completamente. Quindi avvolgere lo stampo di base con della pellicola e conservarlo a meno 70 gradi Celsius fino al momento di tagliarlo con un criostato. Per prepararsi al trapianto di un ricostruito cutaneo su un topo, riempire un contenitore con azoto liquido e aggiungere cinque millilitri di DMEM in un tubo da 50 millilitri.

Riempire un becher con 600 millilitri di acqua del rubinetto e posizionare il becher su un agitatore riscaldante per riscaldarlo. Quindi selezionare un topo femmina senza pelo, outbred, di circa sei settimane di età. Dopo aver anestetizzato il topo con isoflurano.

Utilizzare un cono nasale per mantenere l'anestesia durante tutta la procedura. Applicare un lubrificante oftalmico sterile e fornire un supporto termico per prevenire l'ipotermia. Successivamente, pulire la pelle del mouse con tintura di benzoino composta e salviette imbevute di alcol.

Segnare una linea sulla parte superiore della schiena del topo per mantenere la stessa posizione durante la successiva sutura. Creare un letto della ferita di forma rotonda sulla schiena del topo utilizzando forbici ad iris e pinze, quindi coprire il letto della ferita con garze sterili. Posizionare la pelle rotonda del topo nel tubo da 50 millilitri contenente DMEM.

Immergere il tubo in un contenitore di azoto liquido fino a quando tutto il mezzo e il tessuto non saranno completamente congelati. Successivamente, scongelare il tubo in un becher di acqua calda fino a completo scongelamento. Ripetere questa procedura di congelamento e scongelamento per tre volte.

Utilizzare una lama chirurgica per staccare un ricostrutto cutaneo da un inserto. Rimuovere con grande attenzione la membrana e quindi trasferire il ricostrutto cutaneo sulla superficie del letto della ferita nel topo. Posizionare ora la pelle del topo sopra il ricostrutto cutaneo.

Assicurarsi che la prima sutura sia posizionata sopra il marcatore precedentemente etichettato e che la seconda sia in basso. Quindi utilizzare altre due suture ai lati della ricostruzione cutanea per fissare la pelle del topo. Pulire la pelle del topo dopo il trapianto, quindi posizionare il topo in una nuova gabbia.

Al giorno 18, l'epidermide dei ricostrutti cutanei è composta da strati stratificati di cheratinociti; lo strato basale indifferenziato e gli strati successivamente differenziati sono orientati in senso verticale. Colorazione della sezione dei ricostrutti con il marcatore melanocitico.

S 100, come indicato dalle frecce nere, mostra che i melanociti sono allineati nel livello basale dell'epidermide e comunicano con numerosi cheratinociti attraverso estensioni dendritiche. Il compartimento dermico contiene fibroblasti immersi in una matrice di collagene di tipo uno; il collagene di tipo quattro indica la membrana basale, che separa l'epidermide dal derma. Le figure seguenti illustrano come si sviluppano i diversi strati di cheratinociti nell'epidermide.

Quando le cellule staminali dermiche marcate con un vettore lentivirale GFP vengono incorporate insieme ai fibroblasti in una matrice di collagene di tipo uno, esse migrano verso l'epidermide e si differenziano in melanociti al quinto giorno. Dopo la semina dei cheratinociti, singole cellule iniziano a migrare fuori dalle sfere.

Si noti che l'epidermide è ancora composta da un singolo strato. All'ottavo giorno, alcune cellule raggiungono l'interfaccia tra epidermide e derma.

Al giorno 10, le cellule positive per GFP sono strettamente allineate alla posizione della membrana basale, come si può osservare qui. Le cellule positive per GFP migrate nell'epidermide esprimono il marcatore melanocitico HMB 45. Quando linee cellulari di melanoma a diversi stadi vengono incorporate in ricostrutti cutanei, il comportamento delle cellule riflette le loro caratteristiche in vivo.

Qui, melanociti normali e cellule di melanoma coltivate in colture bidimensionali possono essere osservati in questa figura. La localizzazione e il tasso di crescita dei melanociti normali sono strettamente controllati nei ricostrutti cutanei, come mostrato qui; i melanomi primari in fase di crescita radiale proliferano principalmente nell'epidermide, mentre i melanomi in fase di crescita verticale crescono in modo invasivo nel derma, come visibile in questa figura. Infine, si può osservare qui il modo in cui i melanomi metastatici invadono aggressivamente in profondità nel derma.

I nostri studi sulla pelle normale costituiscono la base per una migliore comprensione dello sviluppo e della progressione del melanoma.