Multi-array di elettrodi Recordings Valanghe neuronali in Culture organotipica

L'obiettivo di questo esperimento è studiare l'auto-organizzazione dell'attività cerebrale sana in valanghe neuronali, il segno distintivo della dinamica in stato critico nella corteccia. Questo risultato si ottiene combinando una sezione coronale stratificata della corteccia con una sezione del mesencefalo, che fornisce importanti input dopaminergici, cruciali nello sviluppo, alla corteccia. Come secondo passo, la coltura co-colturale di corteccia e mesencefalo viene sviluppata su un array multielettrico, che permette la stimolazione e la registrazione dell'attività neuronale in più punti all'interno della coltura.

Successivamente, permettiamo alla coltura co-coltivata di appiattirsi, espandersi e attaccarsi alla superficie della MEA durante le prime una-due settimane in un incubatore appositamente progettato, che espone la coltura alternativamente all'aria normale e alla condizione di coltura. Si ottengono risultati fluidi che mostrano l'auto-organizzazione spontanea di raffiche di potenziali di campo locali spaziotemporali in valanghe neuronali. Tali risultati si basano su registrazioni effettuate mediante MEA e su un'analisi offline delle valanghe, che identifica la legge di potenza nelle dimensioni delle valanghe.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le colture disassociate, è il suo aspetto di neuroscienza sistemica. Possiamo coltivare insieme molte regioni cerebrali e queste colture multiregionali stabiliscono un'organizzazione cerebrale corretta su larga scala, come i livelli corticali e i sistemi di proiezione. Le applicazioni di questa tecnica vanno oltre lo studio delle avalanché di neuroni.

Ad esempio, possiamo studiare lo stimolo in risposta a livello di rete in condizioni in vitro rigorosamente controllate. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché l'applicazione corretta della miscela di trombina plasmatica e il posizionamento del tessuto sull'MEA sono operazioni difficili da apprendere. Questi passaggi richiedono un'accurata tempistica, il giusto gradiente di temperatura e l'evitare di toccare direttamente la delicata superficie dell'MEA.

Per preparare una camera di vetro sterile e sigillabile per le registrazioni, tagliare prima dei cilindri di vetro filettati con un cappuccio in plastica in teflon, approssimativamente a due millimetri dal fondo del filetto. Questi sono necessari per garantire una chiusura sicura e stagna della camera di coltura. Successivamente, pulire gli anelli di vetro risciacquandoli con acqua per tre volte, quindi facendoli bollire per cinque minuti in alcol etilico al 200 proof.

Mettere da parte per far asciugare; è necessaria una soluzione di silicone per fissare gli anelli di vetro alla superficie della MEA. Utilizzare un kit di elastomero siliconico Cell Guard 180 4 e mescolare accuratamente 15 millilitri delle parti A e B. Successivamente, lasciare riposare per 15 minuti per eliminare le bolle d'aria.

Separare la soluzione in un millilitro di Eloqua e conservarla a meno 20 gradi Celsius per un uso futuro. Incollare ora un anello di vetro all'MEA prelevando un millilitro di silicone a 23 gradi Celsius con una siringa munita di ago sottile e applicandolo sulla superficie tagliata non lucidata dell'anello di vetro. Quindi centrare l'anello di vetro sull'MEA e applicare uno strato aggiuntivo di silicone attorno all'esterno dell'anello per sigillare meglio.

Lasciare indurire per uno o due ore a circa 60 gradi Celsius su una piastra riscaldante. Successivamente, sterilizzare la camera MEA e i tappi della camera in cappa a flusso laminare risciacquandoli tre volte con acqua deionizzata e poi tre volte con alcol al 70% per l'ultimo risciacquo. Lasciare la camera in ammollo nell'alcol per 10 minuti.

Successivamente, esporre l'interno della camera e del coperchio alla luce UV per 10 minuti. Autoclavare a 120 gradi Celsius per 45 minuti. Una volta sterilizzati, lasciare asciugare.

Ora ricoprire la superficie della MEA all'interno della camera di coltura con poli-D-lisina. Le nuove MEA utilizzate in questo esperimento sono piuttosto lipofiliche, quindi procedere al rivestimento mediante gocce ripetute. Aspirare la soluzione dalla griglia degli elettrodi.

Applicare il cappuccio per sigillare la camera MEA durante la conservazione e per utilizzi futuri. Questa procedura consente di ottenere sezioni della corteccia e della VTA per circa 12 colture co-coltivate ed deve essere eseguita all'interno di un'area a flusso laminare in condizioni sterili, utilizzando animali sani di uno o due giorni dopo la nascita; il tempo totale per il prelievo del tessuto non deve superare un'ora. Dopo la decapitazione, iniziare il prelievo del cervello effettuando due incisioni laterali con le forbici per rimuovere la cute dal cuoio capelluto.

Rimuovere quindi aprire il cranio utilizzando forbici da occhio fini, effettuando un taglio sagittale mediano e un taglio coronale alla giunzione tra corteccia e cervelletto. Ribaltare all'indietro tutte e quattro le lembi ossee per esporre il cervello. Successivamente, con una spatola affilata, tagliare in senso frontale attraverso il bulbo olfattivo.

Quindi avanzare la spatola a quarti sotto il cervello. Sollevare delicatamente il cervello dal cranio e farlo scivolare nella soluzione di fissazione fredda per un rapido raffreddamento e un immagazzinamento temporaneo.

Ripetere la procedura sopra descritta per altri due cervelli. Per ottenere il tessuto della VTA, trasferire i cervelli su una piastra di Petri sterile e asciutta. Utilizzando una spatola piccola, rimuovere il liquido in eccesso facendo scivolare delicatamente ciascun cervello lateralmente di circa un centimetro.

Quindi, utilizzare un rasoio per rimuovere il bulbo allungato effettuando un taglio verticale coronale a livello del cervelletto. Ora incollare un blocco di agar su un disco di montaggio per stabilizzare meccanicamente i cervelli durante la procedura di taglio. Successivamente, posizionare una sottile linea di colla istantanea, alcuni millimetri davanti al blocco di agar sul disco, facendo attenzione a non far toccare la colla all'agar, utilizzando una piccola spatola.

Trasferire e montare ciascun emisfero cerebrale con il polo frontale rivolto verso il basso. Assicurarsi che i poli frontali siano incollati al disco di montaggio e che i lati ventrali tocchino l'agar senza residui di colla. Questo garantisce una corretta stabilizzazione meccanica durante il taglio e facilita il sollevamento delle sezioni tagliate.

Successivamente, immergere con attenzione e fissare il disco di montaggio con i cervelli montati in un vassoio vibram riempito con soluzione di gaze fredda. Quindi, utilizzando una lametta da rasoio accuratamente pulita, effettuare sezioni coronali dello mesencefalo spesse 400 micrometri alla massima frequenza di vibrazione e a una velocità di avanzamento relativamente bassa; raccogliere e trasferire le sezioni contenenti la VTA, mediante una pipetta per pasta invertita con bulbo a vuoto, in piatti di Petri da 35 per 10 millimetri riempiti con soluzione di gaze sterile e fredda destinata alle sezioni corticali. Ripetere i passaggi precedenti di sezionamento, ma eseguire un taglio verticale tra la corteccia e il cervelletto, quindi montare i quattro cervelli con il polo frontale rivolto verso l'alto.

Prelevare circa tre sezioni coronali dello spessore di 350 micrometri a partire dal livello dello striato. Utilizzando ora un microbisturi realizzato con lame di rasoio spezzate, dissezionare al microscopio stereoscopico sezioni coronali larghe circa due millimetri di corteccia frontale e aree del mesencefalo contenenti la VTA. Raccogliere il tessuto separatamente in piccole capsule riempite con soluzione fisiologica fredda.

Per iniziare il montaggio del tessuto nella camera MEA, posizionare innanzitutto la MEA a temperatura ambiente sotto un microscopio stereoscopico, mettendo a fuoco la matrice di elettrodi. Successivamente, centrare una goccia di 25 microlitri di plasma sulla matrice di elettrodi pulita, priva di polvere e sterile. Utilizzando una spatola piccola, inserire con attenzione una sezione di corteccia e di area tegmentale ventrale (VTA) all'interno della goccia di plasma.

Ora posizionare la MEA su una piastra refrigerante e riacquisire il fuoco. Lasciare raffreddare per circa 15 secondi prima di aggiungere 25 microlitri di trombina nella goccia di plasma. Quindi, utilizzando la punta della pipetta contenente la trombina, distribuire con attenzione la miscela di plasma e trombina mediante piccoli movimenti circolari sulla MEA.

Attenzione a non toccare direttamente l'array di elettrodi fragile. Successivamente, posizionare delicatamente la corteccia sull'array con il margine dorsale lungo la seconda fila di elettrodi dell'array. In questo modo, gli strati superficiali in via di sviluppo copriranno infine il resto dell'array.

Quindi posizionare l'ATV adiacente al margine ventrale della sezione corticale. Ora chiudere e sigillare leggermente la camera MEA per mantenere un'alta umidità. Lasciare l'assemblaggio della coltura MEA a riposo per circa sei minuti all'interno della cappa a temperatura ambiente, in modo da permettere la coagulazione, la trombina plasmatica e la retrazione.

Nel frattempo, ripetere la procedura per preparare altre tre colture. Successivamente, aggiungere con attenzione in piccole gocce 600 microlitri di mezzo di coltura nelle camere di coltura, utilizzando una siringa da un cc con un ago da 25 per cinque ottavi di pollice. Quindi chiudere ermeticamente la camera MEA e posizionare l'assemblato di coltura MEA sul vassoio oscillante all'interno dell'incubatrice.

Dopo due giorni in vitro, aggiungere 10 microlitri di inibitore della mitosi. Successivamente, rinnovare il 60% del mezzo di coltura a quattro giorni in vitro e ogni quattro giorni successivi. Durante la crescita normale, la coltura si appiattirà notevolmente ed espanderà leggermente in direzione dorsale.

A causa dello sviluppo di strati corticali superficiali, una coltura sana è identificata dal suo tessuto opaco di colore grigiastro in campo chiaro. Al contrario, vescicole brillanti e riflettenti, caratteristiche di cellule morte in degenerazione circa 10-12 giorni dopo la preparazione delle colture, indicano che queste sono pronte per la registrazione e la stimolazione. Per iniziare una sessione di registrazione, l'MEA viene trasferita dal vassoio di conservazione al supporto della testa di registrazione.

Per registrare il potenziale di campo locale o LFP, utilizzare un filtro passa-banda da uno a 200 hertz. L'attività multiunità può essere studiata anche mediante un filtro passa-banda da 300 a 3000 hertz. L'attività spontanea sana tende a verificarsi in scariche di dimensioni e durata variabili.

Per studiare la relazione tra attività del potenziale di campo locale (LFP) e attività delle unità, possiamo calcolare le medie di LFP sincronizzate con gli eventi di scarica. Per queste colture corticali, le deflessioni negative del LFP sono correlate alla generazione di potenziali d'azione nei neuroni, al fine di registrare l'attività evocata dallo stimolo. Innanzitutto, la forma d'onda temporale e l'ampiezza degli stimoli vengono definite mediante un software che controlla un generatore di stimoli.

Un paradigma di stimolazione utile è lo shock singolo controllato in corrente, neutro in carica, con forma d'onda quadrata bipolare. Successivamente, si seleziona un elettrodo che verrà utilizzato per erogare gli stimoli. Le risposte LFP tipiche evocate dallo stimolo risultano simili ai burst di attività spontanea.

Il circuito di blanking disconnette gli amplificatori durante la stimolazione per ridurre gli artefatti del segnale e prevenire la saturazione dell'amplificatore. L'elettrodo di stimolazione richiede diversi secondi per ripristinarsi dopo la stimolazione e pertanto non può essere utilizzato per registrare l'attività di risposta. Sulla MEA l'attività tende a manifestarsi in aggregati spaziotemporali, con attività in un elettrodo spesso accompagnata da attività in altri siti.

Nello stesso tempo, qui vengono mostrate le forme d'onda tipiche del potenziale di campo locale (LFP) durante questi periodi di attività, sovrapponendo tre cluster che si verificano a diversi secondi di distanza l'uno dall'altro per ciascun cluster. Deflessioni negative del LFP possono essere osservate in diversi elettrodi all'interno di una finestra di un secondo quando si estraggono i picchi di NLFP che superano una soglia di più deviazioni standard negative; l'attività sotto forma di tempi di picco di NLFP è convenientemente visualizzata in un Rasta in cui colonne di punti rappresentano NPS quasi coincidenti in diversi elettrodi. L'organizzazione spaziotemporale di questa attività è piuttosto complessa.

Colonne che appaiono più o meno omogenee a bassa risoluzione temporale risultano composte da cluster distinti ad alta risoluzione temporale e così via. L'emergere di cluster spaziali, GEOTEMPORALI e di potenziali di campo locali (LFP) è altamente organizzato nelle reti corticali. Più specificamente, l'organizzazione è invariante rispetto alla scala negli avalanche neuronali.

Questo viene dimostrato calcolando la probabilità delle dimensioni degli aggregati a una data risoluzione temporale, Delta T. In questo caso, gli aggregati sono composti da NL FPS che si verificano nella stessa finestra temporale o in finestre consecutive; quando la dimensione di un tale aggregato viene espressa come numero totale di NFPS per aggregato o come ampiezze integrate di NLFP per aggregato, la distribuzione delle dimensioni degli aggregati rivela una legge di potenza con un esponente prossimo a meno 1,5. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come dissezionare con attenzione il tessuto cerebrale e coltivare preparati su array multiellettrici al fine di studiare l'auto-organizzazione dell'attività neuronale.

Questi metodi sono stati utilizzati anche per studiare la relazione tra attività spontanea e attività evocata da stimolo nelle reti corticali.