Preparazione E18 neuroni corticali di ratto per compartimentazione in un dispositivo a microfluidi

Salve e benvenuti nel laboratorio del Dott. Newly John. In un video precedente, abbiamo dimostrato come realizziamo il dispositivo neuronale, una piattaforma che consente al ricercatore di separare i corpi cellulari dei neuroni da una frazione assiale pura. La litografia morbida è la tecnica utilizzata per fabbricare i dispositivi, che consiste nel colare e polimerizzare PDMS su una wafer di silicio contenente il disegno del dispositivo, precedentemente realizzato mediante litografia a fotoni.

In questo video, illustreremo la preparazione di neuroni corticali di ratto spro dolly E 18 e come caricare i neuroni nel dispositivo per neuroni. Vorrei presentarvi Kiana Lee. Lei effettuerà le dimostrazioni oggi.

Prima di iniziare, è importante che tutti i mezzi e i reagenti necessari siano riscaldati a 37 gradi nel bagnomaria. È possibile vedere il mezzo neurobasale, la tripsina allo 0,25% e il DMEM contenente il 10% di FBS. È fondamentale assicurarsi che tutto ciò che viene collocato nella cappa per la riparazione delle cellule sia sterilizzato e passato con etanolo al 70%.

Prima di tutto, la cappa per colture cellulari viene pulita con etanolo al 70%. Successivamente, i supporti in plastica utilizzati per contenere le provette vengono nebulizzati con etanolo. Poi, la pallina di gomma utilizzata nel processo di tri-striatura viene pulita con etanolo.

È importante eseguire questa operazione precocemente, in modo che abbia tempo sufficiente per asciugarsi. Successivamente, i reagenti necessari vengono puliti con etanolo e trasferiti nella cappa. Due frammenti di corteccia fetale di ratto E18, corrispondenti a un singolo cervello precedentemente dissezionato, vengono posizionati in un tubo da 15 ml contenente un ml di soluzione di dissezione ghiacciata, priva di calcio e di magnesio; viene aggiunto un ml di tripsina EDTA allo 0,25% alla corteccia immersa nella soluzione di dissezione, portando il volume finale a due ml e la concentrazione finale di tripsina a 0,125%. Il tubo da 15 ml contenente la corteccia, a cui è stata ora aggiunta la tripsina, viene quindi posto in un bagno termostatato a 37 gradi per otto minuti, mentre la corteccia fetale incuba a 37 gradi in presenza di tripsina.

Tre pipette di vetro sono arrotondate alla fiamma. La punta della pipetta di vetro viene posta a contatto con la fiamma nella zona blu, e ruotata lentamente finché l'apertura diventa arancione. Mentre diventa arancione.

È importante continuare a ruotare la pipetta di vetro per evitare che si collassi. Si noti che le aperture delle pipette di vetro diventano successivamente più piccole. È inoltre fondamentale non rendere le aperture troppo piccole, poiché ciò potrebbe causare la lisi delle cellule dopo che la corteccia è stata incubata per otto minuti a 37 gradi con la tripsina; a questo punto, si aggiungono 10 ml di DMEM contenenti il 10% di FBS alla corteccia per aiutare a interrompere la reazione della tripsina.

Il tubo da 15 ml contenente la corteccia e DMEM con 10% di FBS viene centrifugato a 2.500 giri/min per due minuti. All'interno della cappa a sicurezza biologica, si utilizza un'aspirazione a vuoto collegata a una pipetta di vetro per rimuovere il soprannatante dalla corteccia, avendo cura di non disturbare né dislocare il pellet.

Un ml di mezzo basale neurale contenente B 27 e glutammato viene aggiunto al pellet di corteccia e aspirato delicatamente su e giù con una pipetta. È molto importante non creare bolle d'aria durante l'aspirazione ripetuta, poiché le bolle possono danneggiare le cellule attraverso l'ossidazione. Successivamente, si utilizza la pipetta posteriore levigata a fiamma con l'apertura più larga per triturare la corteccia, collegando una pallina di gomma sterile all'estremità della pipetta e aspirando su e giù circa cinque volte.

Avendo cura di non introdurre bolle d'aria. Ok. Il processo è proseguito con le altre due pipette di vetro, ciascuna con un'apertura ridotta. Come indicato in precedenza, è importante assicurarsi che non vengano introdotte bolle durante il processo di tri-striatura.

Dovresti inoltre notare che non vedi più alcun frammento visibile. È importante continuare la tri-rigenerazione fino a quando non riesci più a vedere alcuno dei frammenti della corteccia nel mezzo. Dopo l'azione, le cellule vengono nuovamente centrifugate a 2.500 giri al minuto per due minuti.

Questo è circa la dimensione del pellet che ci si aspetterebbe da due frammenti di corteccia. Dopo la centrifugazione, il sup natin viene nuovamente rimosso dal pellet cellulare. Dopo la rimozione del super natin, viene aggiunto un ml di mezzo neurobasale contenente B 27 e glutammato alla corteccia e utilizzato per risospendere la corteccia.

Il pellet cellulare viene nuovamente aspirato e rilasciato delicatamente per evitare l'introduzione di bolle d'aria e garantire una distribuzione uniforme e la completa dispersione del pellet. Viene aggiunto un altro mil di mezzo neurobasale alla sospensione cellulare, portando il volume finale a due mil. Successivamente, la sospensione cellulare viene filtrata attraverso un filtro cellulare da 40 micron di BD Biosciences prima di procedere al conteggio delle cellule e alla valutazione della vitalità.

60 microlitri di mezzo basale neurale fresco vengono posti in un tubo microcentrifuga sterile. Successivamente, 20 microlitri di cellule vengono aggiunti ai 60 microlitri di mezzo basale neurale e, infine, 20 microlitri di trian blu vengono aggiunti alle cellule nel mezzo basale neurale. Il trian blu colorerà le cellule che non sono più vive dopo che le cellule sono state colorate con il trian blu.

Preleviamo con pipetta 20 microlitri e li poniamo su un emocitometro, osservandoli quindi al microscopio. Le cellule vitali appaiono chiare e traslucide, mentre le cellule con membrane perforate si colorano di blu a causa del tripan blu. Tipicamente, otteniamo circa 2,5 milioni di cellule e 8 milioni di cellule per corteccia.

Normalmente otteniamo due frammenti di corteccia da un singolo cervello, con le cellule sospese in un volume finale di due mil. Pertanto, la concentrazione finale delle cellule è tipicamente compresa tra 2,5 milioni di cellule per mil e 8 milioni di cellule per mil. Normalmente, carichiamo circa 20 microlitri di cellule per dispositivo.

Questo ci fornisce un intervallo di cellule per dispositivo compreso tra 50.000 e 160.000 cellule. Le densità cellulari possono essere variate in base all'applicazione. Tuttavia, seminare neuroni primari a una densità troppo bassa porta tipicamente alla morte cellulare. I dispositivi, precedentemente preparati e contenenti mezzo basale neurale, vengono portati nella cappa a sicurezza biologica per mantenere la sterilità.

Il mezzo in eccesso dai pozzetti viene rimosso mediante aspirazione a vuoto. Tuttavia, è necessario fare attenzione a non rimuovere tutto il mezzo. Deve rimanere del mezzo nel canale principale; aspirare il mezzo solo dai serbatoi.

Solo 20 microlitri di cellule vengono applicati al serbatoio in alto a sinistra del dispositivo. Le cellule fluiscono all'interno del dispositivo e si attaccano alla superficie trattata con PLL. Qui è possibile osservare le cellule mentre scorrono attraverso il canale principale e si inizieranno a vedere alcune di esse effettivamente attaccate al vetro.

Dopo il caricamento, i dispositivi contenenti le cellule vengono riposizionati nell'incubatrice per circa 10 minuti, per consentire alle cellule di aderire. Trascorsi 10 minuti nell'incubatrice, i dispositivi vengono nuovamente portati all'interno della cappa a sicurezza biologica, i serbatoi vengono riempiti con il mezzo di coltura e successivamente i dispositivi vengono riposizionati nell'incubatrice. Alcuni aspetti importanti da notare: a seconda del tipo di incubatrice e del livello di umidità richiesto, il mezzo di coltura potrebbe dover essere sostituito nei dispositivi ogni due o tre giorni.

È buona prassi posizionare mezzo fresco nei pozzetti superiori e permettere a un po' di mezzo fresco di fluire attraverso il dispositivo e nei canali principali prima di riempire tutti i serbatoi. Qui i neuroni sono visualizzati con il colorante permeabile alle cellule al calcio, che colora le cellule vive. Qui è possibile osservare il compartimento o lato cellulare del dispositivo, che contiene i corpi cellulari, gli assoni e le dendriti.

Mentre spostiamo lo sguardo lungo il dispositivo, è possibile osservare le microscopiche scanalature attraverso cui gli assoni crescono per raggiungere l'altro lato del dispositivo, il lato assone, che contiene una frazione pura di assoni. A scopo dimostrativo, queste cellule marcate con fluorescenza verranno utilizzate per illustrare la procedura di asstomia.

Una delle proprietà del dispositivo neuronale è che consente al ricercatore di eseguire un'esotomia, ovvero il taglio degli assoni dalla frazione assonica pura del dispositivo, al fine di condurre ricerche come lo studio della rigenerazione assonica. Keano dimostrerà ora come eseguire l'esotomia nel dispositivo neuronale; l'esotomia viene eseguita mediante vuoto.

Una pipetta sterile in vetro viene posizionata nell'apertura inferiore del pozzetto sul lato assonale, e il mezzo viene aspirato mediante vuoto. Tutto il mezzo viene completamente rimosso dal lato assonale del dispositivo, inclusa la quantità presente nel canale principale. Per ripetere il processo dopo la rimozione del mezzo, 150 microlitri di mezzo vengono spinti nel canale principale posizionando la punta della pipetta all'apertura del canale principale e premendo con forza la pipetta.

Successivamente, viene applicato il vuoto all'apertura del canale principale e al pozzetto superiore del lato assonale del dispositivo. Ancora una volta, il vuoto viene utilizzato per rimuovere tutto il mezzo dal lato assonale, inclusa la canale principale. Nuovamente, 150 microlitri di mezzo vengono spinti nel canale principale posizionando la punta della pipetta all'ingresso del canale principale e premendo con forza la pipetta.

A questo punto, il ricercatore può osservare il dispositivo al microscopio per verificare l'efficienza del taglio degli assoni. Se gli assoni non sono stati tagliati in modo sufficiente, il processo può essere ripetuto nuovamente secondo necessità. In questo video, abbiamo mostrato come preparare neuroni corticali fetali di ratto al giorno E18 e come caricarli nel dispositivo per neuroni.

Il vantaggio principale di questi dispositivi è la capacità di separare e compartimentalizzare la coltura dei corpi cellulari neuronali da un lato del dispositivo da una frazione pura di assoni dall'altro lato del dispositivo. Speriamo che questo video ti sia risultato informativo e utile. Questo è tutto dal John Lab.

Grazie per aver guardato.