Visualizzazione del DNA ricombinante e Complessi proteina usando la microscopia a forza atomica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere immagini di biomolecole come DNA e proteine in tamponi acquosi in tempo reale mediante microscopia a forza atomica. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando le biomolecole da analizzare. Successivamente, si configura il microscopio a forza atomica e si posiziona una sonda a levetta in modalità frequenza modulata (FM).

La superficie del campione e le biomolecole di interesse vengono quindi immaginate e analizzate. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano dimensioni generali, quantità e organizzazione di DNA, proteine e complessi biomolecolari eterogenei in condizioni tampone mediante microscopia a forza atomica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo delle chaperoni molecolari, ad esempio qual è la geometria STO del complesso tra chaperoni e co-chaperoni associato a un cliente.

Una dimostrazione visiva di questo metodo è vantaggiosa poiché le fasi di preparazione della sonda a leva AFM e Kent potrebbero risultare difficili da apprendere esclusivamente da istruzioni stampate, principalmente a causa delle complessità legate alla loro manipolazione fisica. A eseguire la procedura saranno Morgan Shannon e John Gertz, due studenti del mio laboratorio. Per iniziare, isolare le molecole proteiche o di DNA da immaginare e sospenderle in un buffer acquoso. Dopo averne confermato la purezza, incubare il campione in un buffer di assorbimento AFM su ghiaccio per favorire l'adesione del campione alla mica.

Per i campioni proteici, utilizzare un buffer heaps da 10 millimolari. Per il DNA, un buffer contenente magnesio, composto da 10 millimolari di tris, pH 7,5, 10 millimolari di cloruro di sodio e 2 millimolari di cloruro di magnesio, è adatto per montare la sonda AFM. Posizionare il supporto della sonda con cella liquida sulla relativa stazione di aggancio per l'installazione della mensola.

Individuare la lunga e spessa mensola del puntale in nitruro con sonda affilata da utilizzare per l'imaging. Trasferirla con attenzione nel supporto della sonda per cella liquida, assicurandosi che la punta rimanga rivolta verso l'alto. Successivamente, esaminare la mensola al microscopio ottico per verificare che sia integra e correttamente posizionata nel supporto della sonda per cella liquida.

Quindi rimuovere con attenzione la testa FM dall'insieme a coda di rondine dello strumento stringendo la vite di bloccaggio della testa neurale. Capovolgere la testa FM e inserire con fermezza il supporto della sonda della cella liquida nei quattro perni alla base della testa FM. Infine, reinserire con cura la testa FM nell'insieme a coda dello strumento.

Per preparare ulteriormente un microscopio a forza atomica (FM) prima dell'acquisizione delle immagini dei campioni, spostare le manopole del microscopio ottico integrato per individuare la punta della mensola, quindi regolare le frecce su e giù del controllore ottico nel software per mettere a fuoco la punta della mensola. Utilizzare le manopole di regolazione del laser per allineare il fascio laser alla punta della mensola. Questo è uno dei passaggi più tecnici e complessi del protocollo: il posizionamento viene effettuato manualmente e richiede regolazioni precise delle manopole.

Un attento monitoraggio del laser nel punto di riflessione e nel punto di illuminazione aumenta la probabilità di un allineamento corretto. Successivamente, regolare le manopole del fotodetettore sulla testa FM per centrare il fotodetettore. Posizionare un foglio di mica appena scheggiato, fissato a un disco metallico per campioni FM, sul portacampione magnetizzato posto sopra la piastra del supporto FM.

Ruotare la piastra del supporto FM in modo che il disco del campione sia posizionato per l’imaging iniziale. Utilizzare il controllo della superficie di messa a fuoco del software dello strumento per abbassare la testa FM verso la superficie del disco del campione MICA. Continuare finché non si ottiene una messa a fuoco nitida di caratteristiche distinte sulla superficie di MICA o del riflesso della punta, quindi selezionare l’icona di taratura nel software dello strumento e tarare la mensola.

La frequenza di risonanza delle sonde MSNL o SNL raccomandate è compresa tra 20 e 60 chilohertz. Selezionare un offset del 5% del picco per acquisire l'immagine del campione di MICA. Innanzitutto, portare la sonda a contatto con la superficie di MICA, impostare la dimensione iniziale della scansione a 10 micrometri e la velocità di scansione a un hertz.

Acquisire immagini complete di scansione del campo da 10 micrometri. Quindi ridurre l'area di scansione a cinque, uno e 0,5 micrometri e acquisire immagini complete di ciascun campo. Disinnestare la sonda facendo clic una volta sull'icona di disinnesto nel software dello strumento.

Per ottenere immagini delle biomolecole di interesse, mescolare cinque microlitri del campione preparato con 45 microlitri di tampone di assorbimento fresco. Aggiungere con attenzione 50 microlitri della soluzione contenente la biomolecola a 0,5 microgrammi per millilitro direttamente sulla superficie dei MICUs. Attendere cinque minuti per consentire alle biomolecole del campione di aderire alla superficie di Micah.

Quindi pipettare un ulteriore volume di 50-100 microlitri di tampone di assorbimento nel portaprobe della cella liquida. Avendo cura di non toccare il probe, una testina FM o la MICA con la punta della pipetta, riaggiustare il rilevatore fotografico e riallineare il laser alla mensola secondo necessità. Successivamente, utilizzare il software dello strumento per riattivare il probe.

Aumentare l'area di scansione per identificare le regioni di interesse. Al termine dell'imaging, selezionare l'icona di ritiro nel software dello strumento più volte per sganciare la sonda. Infine, utilizzare acqua distillata per risciacquare accuratamente il portasonda della cella liquida e il disco del campione.

Quindi provare con aria compressa. Qui è mostrato un esempio di un'immagine AFM. Il substrato di mica fornisce una superficie molecularmente piatta sulla quale il DNA e le proteine possono assorbire.

L'acquisizione di immagini di MICA prima dei campioni di biomolecole fornisce un controllo negativo e una valutazione del rumore di acquisizione. Fornisce inoltre un certo grado di sicurezza che la mensola sia correttamente tarata e che l'acquisizione successiva delle immagini del campione sarà di successo. Il DNA plasmidico a doppio filamento presumibilmente superavvolto è facilmente identificabile per l'aspetto asimmetrico e il deposito uniforme sul substrato di Micah precedentemente insignificante.

I complessi proteici di dimensioni discrete sono altresì univocamente distinguibili dal substrato Micah. Le differenze nella dimensione delle particelle indicano l'eterogeneità del campione e possono essere utili per approssimare la proteina, la stechiometria geometrica del complesso o l'attività biochimica. La forma diagonale generale e l'orientamento costante delle particelle proteiche osservate.

Questo è un artefatto di imaging, poiché ci si aspetta che le proteine siano orientate sul substrato Micah in modo casuale. Possibili cause dell'artefatto osservato sono un'anormalità fisica della punta o un imaging FM effettuato a una velocità di scansione troppo elevata, mentre la convoluzione della punta impedisce il calcolo di misure assolute di lunghezza lungo gli assi x e y o di altezza lungo l'asse z; tuttavia, misurazioni relative lungo gli assi x e y possono comunque essere utili per stimare le proprietà biofisiche delle biomolecole immaginate. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di regolare con precisione il cantilever e allineare il rilevatore fotoelettrico, seguendo questa procedura base di FM.

Altri passaggi, inclusa l'uso di una cella per scambio di tampone, possono essere aggiunti per rispondere ad ulteriori domande, come la capacità delle chaperoni molecolari di influenzare il rilascio dei recettori degli steroidi dai loro elementi di risposta sul DNA. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una comprensione migliore di come ottenere immagini di proteine del DNA e complessi biomolecolari mediante microscopia a forza atomica in condizioni tamponate.