Umano In Vitro come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare un saggio di soppressione umano in vitro per misurare la funzione delle cellule Treg e potenzialmente prevedere future perdite della loro funzionalità. Questo viene ottenuto preparando e testando prima delle microsfere codificate, che verranno utilizzate come stimolatori cellulari. Il secondo passaggio consiste nell'isolare cellule T naive CD4 positive CD25 negative, cellule T CD4 positive CD25 basse attivate in vivo e cellule T regolatorie CD4 positive CD25 alte, da irradiare PP BMC da utilizzare come cellule presentanti l'antigene o APC.

Successivamente, vengono allestite colture singole di linfociti T naïve o attivati come cellule risponditrici con le BMC provenienti da P come APC, oppure colture co, nelle stesse condizioni, ma aggiungendo le Treg in un rapporto di uno a dieci. L'ultimo passaggio consiste nel raccogliere le cellule e misurare la loro proliferazione mediante incorporazione di timidina triziata. I risultati finali ottenuti possono dimostrare differenze nella soppressione delle risposte dei linfociti T naïve rispetto a quelle dei linfociti T attivati in vivo.

Il mio nome è Jeff Woodcliff. Le cellule T regolatorie non esprimono marcatori unici sulla superficie cellulare. Pertanto, per misurare in modo affidabile la loro funzione, devono essere isolate utilizzando tecniche che offrono la migliore separazione.

Il principale vantaggio dell'utilizzo del sorting cellulare attivato da fluorescenza rispetto ad altri metodi come l'isolamento max, è che fax offre popolazioni cellulari pure che possono essere ottenute. La funzione cellulare può quindi essere testata in modo affidabile in saggi di soppressione in vitro come dimostrato qui. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla funzione delle treg in soggetti sani e in relazione al diabete di tipo uno, può essere applicato anche ad altre malattie autoimmuni come l'artrite reumatoide umana, il lupus eritematoso sistemico, l'eritema multiforme, la sclerosi multipla e altre. Per rivestire le microsferette attivate da taal con anti-CD3 umano.

Aggiungere un millilitro delle perle attivate M four 50 prelevato dal flacone originale in un tubo da 1,5 millilitri e posizionare il tubo su un supporto magnetico finché tutte le perle non si saranno attaccate alla parete del tubo. Rimuovere quindi il buffer delle perle asportandolo con una pipetta mentre il tubo è ancora sul supporto magnetico. Successivamente, togliere il tubo dal supporto magnetico e aggiungere un millilitro del buffer uno.

Posizionare nuovamente il tubo sul supporto magnetico più volte. Rimuovere il tampone mentre il tubo si trova sul supporto magnetico. Risospendere, sospendere nuovamente le perle in un millilitro di tampone ancora una volta.

Questa volta aggiungere anche 40 microlitri di anti-CD umano tre. Agitare le perle e l'anticorpo a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi aggiungere BSA allo 0,1% peso/volume e continuare ad agitare per le successive 16 ore.

Successivamente, lavare le perle due volte con il buffer due, incubando le perle in un millilitro di buffer due per cinque minuti a due-otto gradi Celsius, quindi rimuovendo il buffer mentre il tubo è nel supporto magnetico. Quindi lavare nuovamente le perle una volta in più nelle stesse condizioni sterili.

Questa volta, utilizzando un millilitro di buffer tre, testare l'efficienza del rivestimento con anticorpo aggiungendo un numero variabile di microsferette rivestite con CD tre per cellula, al fine di determinare il rapporto ottimale, seminando 50.020-5.000 PBMC per pozzetto in triplicato in una piastra a 96 pozzetti. Dopo 72 ore di coltura a 37 gradi Celsius, aggiungere un microcurie di timidina tritiata e proseguire l'incubazione per le successive 16 ore. Raccogliere le cellule in una piastra per il raccolto multiplo o equivalente.

Aggiungere il liquido scintillante e leggere i conteggi al minuto o CPM per pozzetto. Utilizzando un contatore scintillante top count N XT o equivalente, determinare il rapporto tra microsferette e cellule usando quello che fornisce un CPM costantemente superiore a 5.000, ma inferiore a 15.000, come osservato nella nostra esperienza. Un rapporto di tre microsferette per cellula di solito garantisce la stimolazione ottimale sia per le cellule risponditrici che per le cellule Treg in tutti i soggetti umani testati.

Riempire un tubo conico da 50 millilitri con 15 millilitri di fal plus. Eseguire quindi una diluizione uno a sei di 50 millilitri di buffy coat aggiungendo 250 millilitri di PBS al tubo del sangue. Stratificare lentamente 25 millilitri del buffy coat diluito sulla sommità del fial pack senza disturbare gli strati.

Centrifugare a 800 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Con la frenata disattivata, raccogliere con attenzione lo strato di PBMC, che costituisce la fase intermedia bianca tra il fial e il buffer. Se necessario, raschiare le cellule dalla parete del tubo.

Attendere alcuni minuti e raccoglierli nuovamente dalla fase intermedia. Trasferire le cellule in nuove provette da 50 millilitri e lavarle riempiendo le provette con il pellet di PBS. I PBMCs.

Ripetere il passaggio di lavaggio due volte ogni volta. Combinare due pellet cellulari in un'unica provetta e, in definitiva, unire tutti i pellet cellulari in un'unica provetta da 50 millilitri. Quindi utilizzare 20 microlitri delle cellule sospese per determinare la vitalità cellulare mediante esclusione del blu di trian.

Testare la generazione di APC trasferendo un millilitro di PBMC vitali in un nuovo tubo. Quindi aggiungere quattro millilitri di mezzo e irradiare le cellule con 5.000 rad, quindi aggiungere tampone PBS al tubo contenente il resto dei PBMC. Successivamente, dopo aver centrifugato le cellule a 250 × g per 10 minuti a quattro gradi Celsius, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in quattro millilitri della stessa miscela.

Quindi aggiungere 200 microlitri di microsfere Max anti-CD4 ai PBMC e incubare la miscela di cellule e microsfere a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in 40 millilitri di tampone PBS, quindi centrifugare per formare il pellet cellulare. Successivamente, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in otto millilitri di tampone PBS desgasato a temperatura ambiente.

Successivamente, utilizzare filtri di separazione pres per filtrare e separare la sospensione cellulare. Quindi dividere il PBM CS in due provette da 15 millilitri. Aggiungere quattro millilitri dei P BMCs in ciascuna provetta.

Aggiungere saldamente due colonne a un separatore minimax e posizionare dei tubi di raccolta al di sotto di ciascuna colonna. Quindi aggiungere tre millilitri di tampone PBS DGAs in ciascuna colonna; quando non rimane più tampone, stratificare l'intera soluzione cellulare di quattro millilitri proveniente da ciascun tubo sopra le colonne prima che la sospensione cellulare finisca completamente. Aggiungere tre millilitri di tampone PBS DGAs a temperatura ambiente in ciascuna colonna e lasciare che il tampone scorra nei tubi di raccolta.

Aggiungere altro buffer fino a quando non risulta limpido. Pipettare altri cinque millilitri di buffer DGA sulla colonna LS, quindi rimuovere le colonne LS dal separatore Minimax. Posizionare le colonne in nuove provette sterili da 50 millilitri.

Lasciare fuoriuscire mezzo millilitro, quindi spingere lentamente il resto del volume, pari a circa quattro millilitri. Unire ora le due frazioni CD4 positive. Aggiungere quindi fino a 50 millilitri di PBS nel tubo e contare le cellule dopo aver centrifugato a 400 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Risospendere le cellule in due millilitri di tampone PBS. Combinare gli anticorpi da utilizzare per la colorazione dei marcatori in un unico tubo: anti-CD14, anti-CD32, anti-CD116 e, opzionalmente, anti-CD4. Prelevare un’aliquota della miscela per la colorazione del tubo privo di fluorocromo.

Preparare il tubo FMO trasferendo cinque microlitri di sospensione cellulare per millilitro del tubo in un tubo FACS e colorare le cellule con due microlitri della miscela di anticorpi precedentemente preparata. Successivamente, aggiungere cellule non colorate e microsferette rivestite con IgG murina da colorare con un singolo fluorocromo in nuovi tubi FACS individuali da utilizzare come controlli di compensazione per l'ordinamento cellulare. Quindi aggiungere 50 microlitri di anti-CD25 umano PE alla miscela e aggiungere la miscela al resto della sospensione cellulare.

Incubare i tubi a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione delle cellule con il cocktail di anticorpi, aggiungere il buffer PBS alle cellule e quindi centrifugare per ottenere il pellet. Sospendere il pellet in buffer PBS a una concentrazione di 10⁷ cellule per millilitro.

Utilizzare il tubo FMO per impostare la soglia di selezione delle cellule T positive per CD25. Utilizzando questa strategia di gating, impostare innanzitutto un gate intorno alle cellule negative per Fite al fine di escludere le cellule positive per Fitz, che comprendono monociti, macrofagi e tutte le altre cellule non T positive per CD4, come mostrato in questa figura. In un grafico separato, tracciare i gate per le cellule T negative per CD25 e con bassa espressione di CD25 e per le cellule Treg con alta espressione di CD25, come illustrato in questa figura.

Dopo il flusso, dopo aver ordinato i sottoinsiemi cellulari, centrifugare i tubi di raccolta e quindi mantenere le cellule T sul ghiaccio fino al loro posizionamento in piastra. Etichettare una piastra a 96 pozzetti con fondo a U come indicato nella tabella. Sospendere un’aliquota di 50 microlitri di microsferette rivestite con CD3, calcolata in modo da ottenere una concentrazione di tre microsferette per cellula risponditrice per pozzetto, in mezzo completo con il 10% di siero umano AB poolato nella piastra a 96 pozzetti, quindi diluire le APC precedentemente irradiate nel mezzo fino a una concentrazione di cinque per 10 alla quinta cellule per millilitro.

Aggiungere 50 microlitri di cellule nella piastra a 96 pozzetti, quindi aggiungere 2,5 × 10⁴ cellule T CD4 positive CD25 negative o CD4 positive CD25 basse per pozzetto in triplicato. Aggiungere le cellule Treg nella riga B e nei pozzetti etichettati come "solo Treg" della coltura co-coltivata, in un rapporto di 1 a 10 come mostrato qui. Successivamente, incubare la piastra a 37 °C in un incubatore con 5% CO₂ e umidità satura per 72 ore. Successivamente, stimolare le cellule con un microcurie di timidina triziata e quindi proseguire l'incubazione a 37 °C per le successive 16 ore dopo che la timidina è stata incorporata nelle ultime ore della co-coltura.

Utilizzare un raccoglitore a filtro per raccogliere le cellule su una piastra di raccolta multi-screen. Quindi coprire la piastra di raccolta con un coperchio di plastica trasparente precedentemente riempito con un liquido scintillatore. Infine, leggere i CPM per pozzetto.

Utilizzando un contatore a scintillazione, i sottoinsiemi di linfociti T possono essere isolati con elevata purezza mediante questo sistema, come mostrato nella seguente serie di diagrammi a dispersione: i linfociti T CD4 positivi CD25 negativi sono mostrati qui nel quadrante inferiore. Nella figura successiva, si possono osservare linfociti T CD4 positivi CD25 bassi altamente purificati. Una popolazione pura di linfociti T CD4 positivi separati tramite citometria a flusso.

Le cellule Treg CD25 high sono mostrate nel controllo del gate superiore. Coltivi cellulari singoli di APC e Treg provenienti da soggetti sani hanno mostrato una proliferazione minima o nulla rispetto al fondo, misurata mediante incorporazione di timidina, mentre le cellule T naive CD25 negative e le cellule T CD25 low attivate in vivo hanno mostrato una marcata proliferazione, che viene soppressa quando questi tipi di cellule risponditrici sono coltivati in co-coltura con cellule Treg. Sebbene siano state osservate lievi differenze nella capacità delle Treg di sopprimere le cellule risponditrici naive CD25 negative e le cellule T CD25 low attivate in vivo.

Non era un controllo significativo. Coltivure di singolo tipo cellulare di APC e Treg da soggetti a rischio hanno mostrato una proliferazione minima o nulla rispetto al valore di fondo, misurata mediante incorporazione di timidina. Al contrario, cellule T naive CD25 negative e cellule T CD25 low attivate in vivo hanno mostrato livelli di proliferazione inferiori rispetto ai controlli sani.

I linfociti T risponditori sono stati ulteriormente soppressi dai treg e dalle colture co, poiché il saggio genera risultati affidabili. Possiamo inoltre concludere che valori bassi di CPM indicano potenziali difetti nella trasduzione del segnale, che dovrebbero essere ulteriormente indagati in un tipo diverso di studio. La differenza nella capacità dei treg di sopprimere i linfociti T risponditori CD25 negativi rispetto ai linfociti T risponditori CD25 bassi nei soggetti a rischio, tuttavia, era significativa.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come collegare in modo fluido tutti i passaggi necessari per un test funzionale affidabile e riproducibile per la presenza di Treg in soggetti sani e in soggetti con sistemi immunitari compromessi. Ad esempio, in soggetti con diabete di tipo uno.