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Prendere una piastra a fondo piatto a più pozzetti con pozzetti contenenti batteri nei terreni di crescita o batteri nei terreni di crescita integrati con sale biliare.
I sali biliari inducono stress, causando danni cellulari e rilasciando DNA e proteine. Queste biomolecole rivestono il fondo dei pozzetti, consentendo ai batteri sopravvissuti di aderire alla superficie solida.
I batteri attaccati si moltiplicano, formando micro-colonie e producendo autoinduttori, o molecole di segnalazione chimica, che consentono la comunicazione batterica.
Questa comunicazione innesca i batteri a colonizzare e avviare la produzione di sostanze polimeriche extracellulari o EPS, generando un biofilm.
Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno per eliminare i batteri che fluttuano liberamente.
Introdurre una colorazione cristallovioletta che interagisce con il peptidoglicano della parete cellulare batterica, conferendole un colore violaceo.
Rimuovere la macchia in eccesso e asciugare. Sovrapporre con etanolo per solubilizzare il cristallovioletto dalla parete cellulare batterica, cambiando il colore della soluzione.
Una colorazione più intensa nei pozzetti trattati con sali biliari rispetto ai pozzetti non trattati conferma la formazione di biofilm attraverso l'adesione in fase solida.
Innanzitutto, etichettare due provette da 1,5 millilitri come TSB e TSB più BS. Quindi, aggiungere 1 millilitro di TSB o TSB più BS alle rispettive provette.
Quindi, inoculare le provette con 20 microlitri di coltura notturna a una diluizione di 1:50. Quindi, aggiungere 130 microlitri di terreno di controllo non inoculato a ciascuno dei tre pozzetti in una piastra da 96 pozzetti sterile, trasparente, trattata con coltura di tessuto a fondo piatto. Questo sarà il controllo vuoto.
Aggiungere 130 microlitri di coltura inoculata in ciascuno dei tre pozzetti. Dopo aver aggiunto il controllo e la coltura inoculata nei rispettivi pozzetti, incubare staticamente la piastra a 96 pozzetti per 4-24 ore a 37 gradi Celsius. Una volta terminata l'incubazione, impostare il pozzetto di controllo sul lettore di piastre.
Quindi, aspirare il terreno di coltura da ciascun pozzetto. Quindi lavare delicatamente i pozzetti una volta con 200 microlitri di PBS sterile. Dopo il lavaggio, aspirare il PBS, quindi capovolgere la piastra per asciugarla per circa 20 minuti.
È molto importante garantire una rimozione delicata del supporto e un lavaggio delicato per garantire che la matrice EPS non venga disturbata.
Successivamente, aggiungere 150 microlitri di cristallovioletto allo 0,5% a ciascuno dei pozzetti sperimentali e di controllo. Quindi, incubare la piastra per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo cinque minuti, lavare i pozzetti una volta con 400 microlitri di acqua distillata. Aggiungere 200 microlitri di acqua distillata per lavare i pozzetti cinque volte. Dopo tutti e cinque i lavaggi, capovolgete la piastra e lasciatela asciugare completamente, al riparo dalla luce.
Per ottenere risultati coerenti, è importante che i campioni siano accuratamente asciugati prima di procedere.
Dopo che la piastra è completamente asciutta, utilizzare 200 microlitri di etanolo al 95% per decolorare i pozzetti. Lasciare quindi la piastra sullo shaker per 30 minuti a 4 gradi Celsius per evitare l'evaporazione. Dopo 30 minuti, registrare l'OD540 sul lettore di piastre.