Test di suscettibilità antimicrobica del complesso Mycobacterium tuberculosis delle droghe prima e seconda linea per diluizione brodo in un formato micropiastra

Esistono relativamente pochi farmaci disponibili per il trattamento di Mycobacterium tuberculosis, pertanto la resistenza a qualsiasi farmaco è una preoccupazione. Questo articolo video descrive una procedura per testare contemporaneamente la resistenza agli antibiotici di M. tuberculosis a 12 diversi farmaci antimicrobici. Pertanto, la capacità di rilevare rapidamente la resistenza antimicrobica di M. tuberculosis è molto importante nell'ambito degli sforzi volti a controllare l'aumento di ceppi resistenti. Ecco come testare la suscettibilità agli antibiotici.

Il M. tuberculosis viene prima coltivato su terreni solidi o in brodo, ottenendo una sospensione batterica. Viene preparato l'inoculo e aggiunto a una piastra a microtitolazione contenente diverse concentrazioni di 12 farmaci, inclusi farmaci di prima e seconda linea. Dopo l'incubazione, l'entità della crescita in ciascun pozzetto viene determinata manualmente mediante un box con specchio oppure utilizzando un lettore di piastre semiautomatico.

I dati ottenuti indicano la concentrazione minima inibitoria per ciascun farmaco testato e mostrano a quali antibiotici il ceppo di TB testato è resistente. Questi risultati aiutano a scegliere il farmaco appropriato per il trattamento della TB. Ciao, mi chiamo Nancy Ek e sono direttrice del Laboratorio di Micobatteriologia della Mayo Clinic di Rochester, Minnesota.

Oggi descriveremo un metodo per eseguire test di suscettibilità agli antibiotici per Mycobacterium tuberculosis. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la diluizione in brodo macro, è che viene determinata una MIC per ciascun farmaco e vengono testati contemporaneamente 12 antibiotici. A dimostrare la procedura sarà Kurt Jude, specialista della qualità nel mio laboratorio, che lavora su un banco da laboratorio.

Prepararsi per questa procedura etichettando una piastra di agar sangue, tre piastre Middlebrooks sette H 10, un tubo di perline di vetro con soluzione salina Tween e una piastra a microtitolazione con il nome del paziente e il numero di identificazione del campione. Inoltre, etichettare la piastra di agar sangue e le piastre sette H 10 come purezza. Contrassegnare un’etichetta su una di queste piastre sette H 10 come conteggio di colonie uno a uno e l’altra come conteggio di colonie uno a 50.

Quindi posizionare il vassoio nel pass-through. Successivamente, prepararsi a lavorare in un impianto di biosicurezza di livello tre (BSL-3) indossando una tunica con chiusura anteriore, copricapo, guanti, copriscarpe e un respiratore. In questo caso, viene utilizzato un respiratore PAPR.

Quindi recuperare il vassoio dal pass-through. Successivamente, nell'ambiente BSL tre, disinfettare la superficie della cappa a sicurezza biologica. Poi posizionare un tovagliolo di carta imbevuto di disinfettante all'interno della cappa, approssimativamente a sei pollici dal pannello della ventola d'aria, accanto al tovagliolo di carta.

Posizionare anelli inoculatori, pipette e punte, un contenitore appropriato per lo smaltimento dei rifiuti, un nephi, TER e un vortex. Una volta preparato l'incubatore, posizionare l'organismo sul tovagliolo di carta insieme a un portaprovette con uno standard McFarland 0,5, un brodo sette H nove con OADC e un tubo con perline saline. Questa preparazione viene effettuata a partire da un mezzo solido.

Preparare l'inoculo da una coltura su mezzo solido ottenuta da un campione del paziente. Utilizzare un’ansa sterile per prelevare le colonie e trasferirle nel tubo di vetro contenente soluzione salina con Tween e perle di vetro. Vortexare la sospensione per 30-60 secondi.

Ispezionare visivamente il campione, confrontandolo con lo standard McFarland. La quantità trasferita deve essere uguale o maggiore rispetto allo standard. In caso contrario, aggiungere altro campione batterico e vorticare nuovamente.

Dopo aver confrontato con lo standard di McFarland, lasciare decantare l'inoculo per 15 minuti, in modo da permettere ai grumi più grandi di batteri di sedimentare. Successivamente, utilizzare un nefi TER per misurare la densità dei batteri in sospensione e portarla a zero. Il nephi ter.

Posizionare innanzitutto un tubo vuoto con perle saline Tween nel Nephi ter. Premere il pulsante di calibrazione per azzerare lo strumento, quindi inserire lo standard McFarland 0,5 nel Nephi ter e premere nuovamente il pulsante di calibrazione. Una volta calibrato lo strumento, rimuovere lo standard McFarland e inserire l'inoculo.

La lettura dell'inoculo deve essere uguale alla lettura dello standard di McFarland. Se la lettura è troppo bassa, rimuovere il tubo e trasferire altri batteri dalla piastra. Quindi vortexare e leggere nuovamente il campione.

Se il valore è troppo elevato, aggiungere al tubo del tween salino e vorticare. Quindi leggere nuovamente il campione. Continuare ad aggiustare l'inoculo secondo necessità fino a quando la concentrazione dei batteri corrisponde allo standard di McFarland.

Successivamente, utilizzare una pipetta da 200 microlitri e una punta aerosol-resistente lunga per prelevare 100 microlitri di inocolo dal terzo superiore del tubo. Per evitare grumi che si depositano sul fondo, inoculare il brodo Middlebrook 7H9 e vorticare lentamente il brodo inoculato per 20 secondi per piastrare l'inoculo. Iniziare rimuovendo la piastra a microtitolazione dalla confezione del produttore. Se l'essiccante è blu o se la confezione in foglio di alluminio è danneggiata, non utilizzarla.

La piastra contiene già i 12 antimicrobici da testare in ciascun pozzetto, inclusi i farmaci più efficaci o di prima scelta e i farmaci di seconda linea. Versare con attenzione l'inoculo di brodo H nine sette in un trth, avendo cura di non generare aerosol. Successivamente, posizionare la piastra a microtitolazione con l'etichetta rivolta verso l'esterno come mostrato qui, e utilizzare una pipetta a 12 canali per aggiungere 100 microlitri di inoculo in ciascun pozzetto.

Successivamente, preparare le piastre per eseguire il conteggio delle colonie. Per prima cosa, preparare una piastra non diluita trasferendo un'ansa da un microlitro di campione dal pozzetto del controllo positivo alla piastra H 10 sette etichettata uno a uno. Quindi utilizzare l'ansa per effettuare lo streaking della piastra come mostrato qui.

Successivamente, per preparare una diluizione da uno a 50, trasferire un’ansa da un microlitro dal pozzetto del controllo positivo e agitarla nel tubo contenente 50 microlitri di acqua. Depositare un microlitro di questa diluizione sulla piastra etichettata uno a 50. Inoculare le piastre di purezza pipettando 50 microlitri dell'inoculo dal trth su piastre di agar sangue e piastre 7 H 10 opportunamente etichettate e seminare per isolamento.

Quindi impilare un altro trth sopra il trth inoculato e posizionarli delicatamente nel contenitore per rifiuti. Applicare un sigillo adesivo sulla piastra a microtitolazione. Successivamente, utilizzando il supporto bianco, premere con fermezza su ogni pozzetto per garantire un'adeguata chiusura, assicurandosi che non ci siano pieghe.

Disinfettare la piastra microtitolatrice passando un tovagliolo di carta imbevuto di un disinfettante battericida tubercolare. Successivamente, inserire la piastra microtitolatrice in un sacchetto di plastica e chiuderlo con una sigillatrice termica. Infine, disinfettare tutti i materiali, inclusi il nefi, il vortice per filtri, le piastre e le provette, passandoli con un disinfettante battericida tubercolare.

Qui lo spray pro viene utilizzato dopo che è trascorso un tempo sufficiente per garantire la disinfezione. 15 minuti per lo spray pro. Le piastre vengono sigillate con nastro adesivo trasparente, inserite in sacchetti di plastica e le forniture sigillate vengono rimosse dalla cappa a sicurezza biologica e collocate nel pass-through.

Il sacco rosso per gli scarti a questo punto viene chiuso e sigillato con un fermo-cavo, quindi si rimuovono la tunica, le soprascarpe e i guanti. Dopo essersi recati nella stanza di pre-ingresso e aver lavato le mani, si rimuove il respiratore, lo si disinfetta e conserva dopo aver nuovamente lavato le mani, si indossa una tunica pulita e si lascia l'ambiente BSL tre. Successivamente, il contenitore degli scarti viene sterilizzato in autoclave.

In seguito, incubare la piastra a microtitolazione e le sette piastre H 10 e piastre per sangue in posizione eretta nell'incubatore a 35-37 gradi Celsius con il 5-10% di CO2 nel laboratorio di livello di sicurezza biologica due. Questo è accettabile perché la piastra è ben sigillata e contenuta in un sacchetto di plastica. Il tempo di generazione di Mycobacterium tuberculosis è di circa 12-24 ore, quindi dovrà trascorrere almeno una settimana prima che la crescita possa essere osservata come formazione di un pellet cellulare sul fondo del pozzetto di controllo. Al giorno 10, effettuare una lettura manuale con lo specchio posizionando la piastra sigillata per test di sensibilità su piattaforma dello specchio.

Utilizzare una lampada da tavolo per aiutare a visualizzare la crescita, regolando se necessario per ottenere il miglior contrasto. Controllare le pozzette di controllo della crescita, in questo caso H 11 e H 12, guardando nello specchio. Se è presente crescita, la pozzetta apparirà torbida o sembrerà contenere del sedimento, come mostrato qui.

Se non c'è crescita, come mostrato in questo esempio, il pozzetto apparirà chiaro. In questo caso, riposizionare la piastra nell'incubatore e continuare l'incubazione fino a 21 giorni. Per ogni condizione, confrontare la crescita con il controllo.

Bene, allora, per ogni farmaco, la prima diluizione in cui non si osserva crescita. Questa è la concentrazione minima inibitoria, o MIC, del farmaco. Per esaminare i risultati utilizzando un lettore automatizzato di piastre come il Vision, iniziare aprendo il software Myco TB a ST plate ed effettuando l'accesso. Posizionare quindi la piastra sigillata con il codice a barre rivolto verso l'esterno. Come mostrato qui, la crescita appare come torbidezza o come deposito di cellule sul fondo di una pozzetta sullo schermo del computer.

Prima di tutto, esaminare i controlli di crescita. Come in precedenza. Se la crescita è negativa, rimettere la piastra nell'incubatrice per un massimo di 21 giorni.

Se il risultato è positivo, registrare i risultati toccando il primo pozzetto che non mostra crescita sullo schermo per ciascun farmaco. In alcuni casi, i batteri, il sedimento o i farmaci precipitano sul fondo del pozzetto. Questo fenomeno, noto come "trailing", è indicato da diversi pozzetti con pellet di uguale dimensione e non viene considerato effettivamente una crescita positiva.

Successivamente, le sette piastre di H 10 e agar sangue vengono esaminate per determinare le concentrazioni batteriche e valutare la purezza. La piastra di agar sangue non dovrebbe mostrare alcuna crescita dopo 48 ore. La crescita sulla piastra di agar sangue indica contaminazioni con batteri a crescita rapida.

Se è presente crescita, il test del microtitolatore deve essere ripetuto. La piastra di purezza H 10 sette deve mostrare la crescita di un solo organismo. Il ceppo di tubercolosi EM deve apparire di colore paglierino, rugoso e irregolare. Se contaminato, il test del microtitolatore deve essere ripetuto a partire da una coltura pura.

Per valutare la concentrazione batterica, contare le colonie sulla piastra H 10. Quindi, utilizzando la tabella nel documento scritto allegato, calcolare il numero di colonie. Mycobacterium tuberculosis è stato isolato da un campione di paziente e la resistenza agli antibiotici è stata valutata come descritto in questo video; nella piastra mostrata qui, sono presenti 12 diversi farmaci in concentrazioni crescenti, con le concentrazioni più elevate in alto e quelle più basse in basso.

La concentrazione minima inibitoria, o MIC del farmaco, è indicata dalla più bassa concentrazione del farmaco che non mostra alcuna crescita ed è cerchiata nell'immagine mostrata qui, utilizzando punti di rottura standardizzati stabiliti dall'Clinical and Laboratory Standards Institute. I dati mostrati qui suggeriscono che questo ceppo di TB sarà resistente all'Isid e alla rifampicina. In vitro, le alte MIC osservate in diversi altri farmaci, tra cui oin, moxifloxacina, streptomicina e rifabutina, suggeriscono la resistenza del ceppo di tubercolosi EM a questi agenti.

I risultati del MIC devono essere utilizzati da uno specialista in malattie infettive esperto nel trattamento della tubercolosi per sviluppare un piano di trattamento personalizzato. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica richiede circa 40 minuti per allestire un isolato. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che questo è un agente patogeno respiratorio e che, una volta effettuata la distribuzione, si possono generare aerosol. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire il test di suscettibilità antimicrobica su Mycobacterium tuberculosis mediante il metodo di diluizione in microbrodo. Non dimenticare che lavorare con Mycobacterium tuberculosis può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come la protezione respiratoria devono essere sempre adottate laddove richieste.