Mappatura dei circuiti neuronali inibitori da fotostimolazione scansione laser

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare l'organizzazione funzionale locale dei circuiti neuronali inibitori. La procedura inizia con la preparazione di fette cerebrali vive dalla corteccia somatosensoriale primaria di topi. Il passo successivo consiste nel visualizzare e registrare attività dalle popolazioni cellulari inibitorie che esprimono GFP mirate all'interno della fetta cerebrale.

Successivamente a questa stimolazione fotoelettrica mediante scanning laser tramite glutammato, si utilizza l'uncaging per attivare piccoli gruppi di neuroni pre-sinaptici in modo eccitatorio o inibitorio. Le correnti post-sinaptiche vengono registrate nei neuroni interneuronali che esprimono GFP. L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire la stimolazione fotoelettrica, l'analisi dei dati e generare mappe quantitative degli input sinaptici ai neuroni registrati.

In definitiva, la stimolazione fotoelettrica con scansione laser combinata con registrazioni in configurazione "whole cell" consente la costruzione di mappe dettagliate degli input sinaptici verso specifici tipi di neuroni inibitori, permettendo così di determinare l'organizzazione e la funzione dei circuiti corticali inibitori locali. La tecnica basata sulla foto-stimolazione è stata ideata dal Dott. Larry Katz e Ned Calloway, e ulteriormente sviluppata dal Dott. Carols Waboda, il mio responsabile scientifico. Il Dott. Xing Z si è formato presso il Dott. Calloway, presso l'Istituto Salk, dove ha guidato numerosi studi sull'architettura dei circuiti interorali. Attualmente, il nostro gruppo sta ampliando e proseguendo questi studi, concentrandosi sui circuiti interorali.

Per iniziare questa procedura, sacrificare un topo transgenico di due-tre settimane postnatale mediante decapitazione ed estrarre rapidamente il cervello, quindi posizionare il cervello in una soluzione di taglio congelata e ossigenata. Successivamente, utilizzare gli occhiali GFP per esaminare visivamente il cervello e verificare l'espressione di GFP. In seguito, tagliare la corteccia somatosensoriale primaria in sezioni dello spessore di 400 micrometri utilizzando un vibratomo.

Incubare le sezioni nel liquido cerebrospinale artificiale (A CSF) contenente saccarosio, saturato con 95% O2 e 5% CO2, a 32 gradi Celsius per 30 minuti fino a un'ora. Successivamente, trasferire le sezioni nel normale A CSF a temperatura ambiente per preparare il laser all'esperimento: accendere il sistema di raffreddamento del laser e l'alimentazione elettrica. Quindi, accendere tutti i componenti hardware relativi al controllo della foto-stimolazione, inclusi il sistema di specchi deflettori, il modulatore ottico, l'otturatore elettronico e l'amplificatore di ingresso per fotodiodo.

Successivamente, accendere l'apparecchiatura elettrofisiologica, come l'amplificatore Multi Clamp 700 B e i micromanipolatori. Le registrazioni elettrofisiologiche, la fotostimolazione e l'imaging vengono effettuate nella camera di perfusione per fettine montata sullo stadio motorizzato del microscopio. Dopodiché, accendere la telecamera per l'imaging: la fettina verrà visualizzata nel microscopio eretto mediante ottiche infrarosse DIC ed epi fluorescenti attraverso il sistema di imaging.

Quindi aprire il software FS basato su MATLAB e il software della fotocamera Q Capture sul monitor. Prima di eseguire l'esperimento, verificare il sistema di stimolazione luminosa con laser e assicurarsi che si trovi in uno stato operativo. Posizionare un foglio di carta sotto l'obiettivo del microscopio 4x per osservare il modello di scansione del laser mentre il sistema è in funzione.

Per ottenere un microelettrodo con una resistenza compresa tra quattro e sei megaohm, tirare un elettrodo di vetro mediante il puller per pipette. Successivamente, riempire l'elettrodo con una soluzione interna contenente lo 0,1% di biotina per l'etichettatura cellulare e l'identificazione morfologica. Quindi, accendere il sistema di perfusione sotto pressione per pompare un ACSF nella camera.

Assicurarsi che il livello del fluido nella camera sia costantemente di 2,0 millimetri sopra la sezione. Un’aliquota della soluzione madre di glutammato incapsulato MNI viene aggiunta a 25 millilitri di A CSF circolante per ottenere una concentrazione di 0,2 millimolare di glutammato incapsulato. Successivamente, trasferire una sezione cerebrale nella camera di registrazione.

Eseguire il sistema di acquisizione immagini per verificare la qualità della sezione e localizzare anatomicamente l'area somatosensoriale primaria. Successivamente, fissare la sezione con un anello di platino filato su misura, avendo cura di non posizionare l'ancoraggio sulla regione cerebrale destinata alla registrazione. Visualizzare le cellule mediante un obiettivo 60x, basandosi sulla visualizzazione dell'espressione di GFP al microscopio fluorescente DIC.

Identificare e selezionare i tipi di cellule inibitorie. Si noti che la registrazione verrà eseguita sotto controllo visivo assistito da microscopia DIC a infrarossi. È necessario monitorare il video e commutare tra le modalità DIC e fluorescente per confermare la posizione della cellula GFP mentre si abbassa l'elettrodo fino alla cellula bersaglio.

Utilizzando la tecnica convenzionale di patch clamping. Applicare innanzitutto una pressione positiva all'elettrodo. Avvicinarlo alla superficie della cellula per creare una fossetta visibile sulla membrana cellulare bersaglio.

Applicare quindi rapidamente una pressione negativa per formare un sigillo giga e rompere la membrana cellulare, monitorando nel contempo le risposte all'iniezione di corrente sul monitor video. Una volta effettuata la perforazione, acquisire le immagini del neurone intrinseco che esprime GFP registrato, con un ingrandimento di 60x, in modalità DIC e in fluorescenza, per la verifica in tempo reale. Prima di raccogliere i dati di stimolazione luminosa, iniettare impulsi di corrente iperpolarizzanti e depolarizzanti per esaminare le proprietà elettrofisiologiche di base di ogni cellula.

Una volta raggiunta la stabilità e ottenuta una registrazione in whole cell con una buona resistenza di accesso, solitamente inferiore a 20 megaohm, passare dall'obiettivo del microscopio da 60x a 4x per la foto-stimolazione mediante scansione laser, acquisire un'immagine della sezione a 4x e utilizzarla per guidare e registrare i siti di foto-stimolazione. Impostare i parametri di foto-stimolazione e di acquisizione dei dati attivando il modulo di commutazione di configurazione di phys. Utilizzare un impulso laser di un millisecondo di circa 20 milliwatt con un intervallo di stimolazione di un secondo.

Per la mappatura mediante stimolazione luminosa, acquisire tracce di dati di un secondo campionate a 10 chilohertz. Successivamente, caricare l'immagine della sezione x in quattro nel modulo mapper di phys. Definire la posizione del soma e impostare i siti di stimolazione luminosa secondo uno schema 16 per 16 con dimensioni di 80 micrometri per 80 micrometri.

Spaziatura intorno alla posizione della cellula, che comprende tutti gli strati corticali. Successivamente, mappare il profilo di eccitazione del neurone registrato esaminando le posizioni di generazione degli impulsi in risposta alla foto-stimolazione in modalità di blocco del potenziale. Il nostro software intuitivo, dotato di funzionalità di visualizzazione in tempo reale, facilita gli esperimenti di mappatura.

In seguito, mappare le connessioni della rete eccitatoria locale rilevando le correnti postsinaptiche eccitatorie dalla cellula registrata. Con la scansione laser in diverse posizioni, mantenere la cellula a meno 70 millivolt in modalità clamp di tensione per rilevare le correnti eccitatorie entranti. Quindi ripetere le mappe delle correnti postsinaptiche eccitatorie da due a tre volte, ruotando o invertendo il pattern di stimolazione fotoindotta. Per mappare le connessioni della rete inibitoria locale, rilevare le correnti postsinaptiche inibitorie dalla cellula registrata.

Mantenere la cellula a un potenziale prossimo a zero millivolt, in questo caso a meno 15 millivolt, in modalità voltage clamp al fine di rilevare le correnti inibitorie uscenti. Dopo aver completato tutti i saggi fisiologici, rimuovere delicatamente l'elettrodo dalla cellula registrata. Rimuovere la sezione di tessuto cerebrale dalla camera e fissarla in paraformaldeide al 4% per tutta la notte, quindi colorare le cellule registrate con biotina.

In questo esperimento, la combinazione dell'espressione di GFP, delle caratteristiche intrinseche di elettrofisiologia e di morfologia viene utilizzata per classificare i neuroni inibitori. Qui vengono mostrati un esempio e una mappa di dati grezzi per illustrare la foto-stimolazione mediante scansione laser, che permette una mappatura estesa delle connessioni locali del circuito corticale al neurone inibitorio registrato. Di seguito sono riportati esempi di mappe quantitative di input codificate a colori, derivate dai tracciati grezzi appena mostrati nella Figura D. Le ampiezze degli eventi sinaptici rilevati nel neurone interneuronale registrato sono codificate a colori e sovrapposte topograficamente sulle posizioni di foto-stimolazione.

La posizione del corpo cellulare è indicata dal cerchio rosso vuoto nella barra della scala. I colori caldi indicano input sinaptici forti, mentre i colori freddi indicano una connettività debole o assente con la cellula bersaglio. Analogamente, la figura E mostra il numero di eventi sinaptici per ogni posizione di uncaging campionata nel neurone registrato.

La figura F mostra il tempo di insorgenza del primo evento sinaptico rilevato nella cellula registrata dopo la stimolazione fotoelettrica, indicato nella barra della scala. I colori caldi indicano un'entrata breve, con bassa latenza, mentre i colori più freddi indicano latenze sinaptiche più lunghe. Pertanto, la LSPS consente la costruzione di mappe dettagliate della posizione, intensità, latenza e numero di connessioni che convergono su specifici tipi di neuroni inibitori.

Beh, durante questa procedura, è importante essere pazienti, creare condizioni sperimentali pulite ed effettuare con attenzione e precisione il passaggio dall'oggettivo ad alto ingrandimento a quello a basso ingrandimento. Infine, utilizzare molto bene il software di analisi.