L'uso di una trappola ottica per lo Studio delle interazioni ospite-patogeno per Dynamic Imaging Live Cell

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare il trappolamento ottico abbinato alla microscopia confocale a disco rotante per osservare in tempo reale le interazioni tra patogeno ed ospite. Questo risultato si ottiene innanzitutto aggiungendo i patogeni di interesse a una camera in vetro coprioggetto. Successivamente, una particella viene selezionata e catturata mediante il trappolamento ottico.

Infine, la particella viene indirizzata alla cellula di interesse. Come mostrato qui. Il trappolamento ottico può essere un metodo efficace per controllare due particelle durante l'osservazione di interazioni intracellulari dinamiche.

Questo metodo può rispondere a domande importanti riguardanti le interazioni tra ospite e patogeno nei campi delle malattie infettive e dell'immunologia, come ad esempio quale sia l'effetto sulla fagocitosi quando si ottiene un controllo completo delle relazioni spaziali tra cellule dell'ospite e patogeni, e se l'ordine con cui i patogeni vengono internalizzati da una cellula fagocitica influisce sulla maturazione del fagosoma. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà poiché le condizioni di intrappolamento devono essere ottimizzate per diversi tipi di cellule e di microsfere. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per il processo di configurazione e integrazione di un disco rotante.

Il confocale abbinato a una trappola ottica è difficile da concepire a causa dell'allineamento preciso necessario per tutti i componenti ottici. Raccogliere il patogeno di interesse. Ad esempio, in questo caso, 300 microlitri di Candida albicans coltivati tutta la notte in brodo vengono prelevati dalla coltura e i patogeni vengono trasferiti in una provetta da reazione da 1,5 millilitri.

Quindi lavare i patogeni tre volte a circa 1300 G per cinque minuti a temperatura ambiente, aspirando il soprannatante e lasciando inalterato il pellet ogni volta, risospendendolo in PBS e sottoponendolo a sonica. Dopo il terzo lavaggio, risospendere il pellet in 500 microlitri di PBS. Successivamente, sciogliere un milligrammo del colorante di prova in 100 microlitri di dimetilformammide per ottenere una concentrazione finale di 10 milligrammi per millilitro.

Quindi aggiungere tre microlitri della miscela di colorante al tubo della reazione contenente i patogeni lavati. Avvolgere i tubi con della stagnola poiché i coloranti sono sensibili alla luce e agitare il campione a 37 gradi Celsius per un'ora, quindi centrifugare e lavare il campione in PBS 3 volte come in precedenza. Risospendere il pellet in 300 microlitri di PBS dopo l'ultimo lavaggio.

Riscaldare il mezzo e il PBS a 37 gradi Celsius in un bagno a acqua. Lavare una piastra da coltura tessutale da 10 centimetri ricoperta con macrofagi RAW 264.7 due volte con PBS, aspirando il PBS tra ogni lavaggio. Successivamente, ricoprire la superficie della piastra con cinque millilitri di tripsina e incubare la piastra per cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Battere delicatamente il lato della piastra per staccare le cellule dalla superficie. Fare attenzione a non far schizzare la tripsina all'esterno della piastra. Aggiungere ora cinque millilitri di mezzo alla piastra e trasferire la miscela in un tubo da reazione.

Dopo la centrifugazione, aspirare il mezzo con attenzione per non disturbare il pellet e risospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo. Aggiungere 400 microlitri di mezzo in ogni camera di una camera da coltura, quindi aggiungere cinque microlitri di sospensione cellulare in ciascuna camera. Lasciare crescere le cellule tutta la notte in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5%CO2.

Estrarre la camera portaoggetti dall'incubatore e aggiungere da 5 a 10 microlitri dei patogeni precedentemente preparati e marcati con fluorescenza in ciascuna camera contenente i macrofagi. Mescolare accuratamente macrofagi e patogeni aspirando e dispensando con la pipetta, avendo cura di non toccare il fondo della camera per non disturbare i macrofagi aderenti. Accendere tutti i componenti del microscopio confocale a disco rotante.

Preparare il microscopio aggiungendo olio all'obiettivo ad immersione oleosa. Inserire la camera portaoggetti nel supporto specializzato, quindi rimuovere il coperchio della camera portaoggetti e allineare il microscopio per l'immagine in contrasto di fase (DIC). Accendere l'otturatore per il trappolamento ottico e il laser a infrarossi (IR).

Quindi aprire l'otturatore del laser verso il trappola ottica. Verificare che l'otturatore davanti al laser a infrarossi sia chiuso controllando con la scheda a infrarossi. Ora mettere a fuoco i macrofagi sul vetrino aderente.

Quindi individuare i patogeni liberi in soluzione adiacenti ai macrofagi. La parte più difficile di questa procedura consiste nel trovare l'oggetto giusto da tracciare nella camera di campionamento, a causa delle forze di adesione tra l'oggetto e il vetrino coprioggetto presente nella camera di campionamento. Per spostare tale oggetto, è necessario muovere il tavolino mentre l'oggetto è trattenuto dal laser di trappola; è inoltre fondamentale notare che il tavolino deve essere spostato con una velocità sufficientemente bassa affinché la forza di trascinamento esercitata dal tavolino non superi la forza massima di trappolamento esercitata dalla trappola ottica.

Spostare la piastra in modo che il patogeno si trovi nelle vicinanze della trappola. Quindi aprire l'otturatore e attivare la trappola. Spostare il campione per mettere i macrofagi a contatto con un'immagine del patogeno immobilizzato.

I patogeni sono stati osservati con un microscopio confocale a disco rotante in DIC, in fluorescenza o in una combinazione di entrambi; popolazioni distinte di Canada albicans, che sono tipicamente di circa cinque micron di dimensione, sono state etichettate in verde, blu e rosso. Per illustrare l'acquisizione di immagini, un singolo C albicans è stato intrappolato e spostato lungo un percorso quadrato attraverso un aggregato di altri lieviti, come indicato dalle frecce grigie, dimostrando la capacità di catturare e manipolare la posizione specifica di un singolo patogeno selezionato dall'operatore anche in un ambiente affollato. Per illustrare ulteriormente la flessibilità di questo sistema nell’intrappolare le diverse morfologie di forma esibite dagli organismi patogeni mostrati in questa figura, la pinzetta ottica è stata utilizzata per trattenere e posizionare una particella di C albicans dotata di pseudomifa.

Il C albicans è marcato con un colorante rosso e spostato lungo un percorso indicato dalla freccia bianca, quindi posizionato accanto a cellule raw GFPL C3 fluorescenti. In verde. La porzione lievito dell'albicans è stata intrappolata mentre il pseudomifa avanzava.

Anche la dea Aspergillus fum è stata posizionata accanto a una cellula macrofagica di topo non trattata al fine di analizzare l'intervallo di tempo assoluto di fagocitosi con questa particolare linea cellulare e patogeno. In questa figura, le immagini in campo chiaro mostrano come l'Aspergillus intrappolato, indicato dalla freccia bianca, sia stato spostato e posizionato lungo il percorso indicato dalla freccia rossa. Il patogeno intrappolato è leggermente fuori fuoco a causa della trappia che spinge l'organismo leggermente al di sopra del piano focale.

Aspergillus è stato spostato finché non è stato posizionato adiacente alla cellula grezza desiderata. Una volta che il patogeno ha fatto contatto con la cellula, il trappola è stata spenta. Il processo di fagocitosi è stato attivato ed è stata utilizzata l'immagine a intervalli per osservare i successivi eventi cellulari.

Dopo 30 secondi, la membrana della cellula grezza ha iniziato a modificarsi formando una coppa attorno alla particella. A 60 secondi, la coppa era completamente formata. Tra 90 e 150 secondi, l'Afu Gotti stava venendo inglobato, e a 180 secondi la particella era completamente internalizzata.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come realizzare un apparato per il trappolamento ottico a disco rotante e di come tale strumento possa consentire di controllare in modo non invasivo i patogeni durante l'acquisizione di immagini di cellule vive dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle interazioni ospite-patogeno per indagare il ruolo delle relazioni spaziali tra cellule dell'ospite e patogeni, e il loro impatto sulla risposta immunitaria conseguente.