Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica
13 novembre 2011
Il profilo dell'espressione dell'RNA in regioni cerebrali murine discrete richiede una strategia di raccolta dei tessuti precisa e ripetibile. Viene qui descritto un protocollo che utilizza sia il sezionamento coronale del cervello sia la microdissezione assistita da corer tissutale. Il rendimento e la qualità dell'RNA totale ottenuti dai campioni risultanti confermano l'utilità del metodo delineato.
L'obiettivo generale di questa procedura è raccogliere RNA totale da nuclei cerebrali discreti in modo ripetibile, consistente, economico e privo di RNAsi. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto un ambiente di lavoro privo di RNAsi ed estraendo l'intero cervello da un topo decapitato. Successivamente, un tagliere per tessuti azionato da micrometro viene utilizzato per ottenere sezioni seriali di tessuto di dimensioni uniformi.
Successivamente, le regioni cerebrali di interesse vengono microdissecate utilizzando un campione di tessuto di diametro definito, mantenendo il tessuto in un ambiente privo di RNA. Infine, l'RNA totale viene isolato dai nuclei cerebrali escissi. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano una resa e qualità sufficienti di RNA totale per la preparazione di librerie di cDNA e il profilo del trascrittoma mediante saggi spettrofotometrici o fluorometrici.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'anatomia macroscopica o l'escissione di regioni cerebrali assistita da microscopia a cattura laser, è che è possibile raccogliere da un singolo cervello murino molteplici regioni cerebrali distinte in modo ripetibile e sufficientemente conveniente in termini di costi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, ad esempio se profili distinti di espressione trascrizionale all'interno di regioni cerebrali associate a circuiti neuronali non possano essere correlati a determinati tratti comportamentali, risposte ambientali e/o stati patologici. Per prepararsi alla microdissezione, aggiungere a 100 millilitri di soluzione salina equilibrata di Earle (EBSS) 0,44 grammi di bicarbonato di sodio e 0,884 grammi di glucosio.
Trattare l'EBSS con 0,1 millilitri di DEPC in un flacone o beuta autoclavabile con tappo a vite per almeno 12 ore. A 37 gradi Celsius. Posizionare pipette di vetro di cinque pollici e tre quarti in un beuta di vetro da un litro e inserire i pennelli da disegno con le setole rivolte verso l'alto in un cilindro graduato di vetro da 100 millilitri.
Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di acqua trattata con DEPC per coprire le pipette e i pennelli. Coprire il becher e il cilindro graduato con carta d'alluminio e incubare per almeno 12 ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione di 12 ore con il DEPC, riscaldare tutti i materiali trattati con il DEPC a una temperatura superiore a 100 gradi Celsius per almeno 15 minuti. Raffreddare. L'EBSS a temperatura ambiente prima dello stoccaggio a quattro gradi Celsius.
Versare l'H2O DD dal becher e dal cilindro graduato e continuare a incubarli a una temperatura superiore a 100 gradi Celsius fino a quando i materiali non saranno completamente asciutti. Rimuoverli dall'incubatrice, farli raffreddare a temperatura ambiente e conservarli per un uso successivo. Nel giorno dell'esperimento, trattare tutte le superfici di lavoro per eliminare la contaminazione da RNA e posizionare il EBSS in un bagnomaria regolato a 40 gradi Celsius per tamponarlo e ossigenarlo.
Infiltrare l'EBSS con il 5% di CO2 e il 95% di ossigeno inserendo un tubo per gas in una pipetta da pascolo priva di RNA e introducendo la pipetta nell'EBSS, coprendo l'apertura del contenitore dell'EBSS. Impostare un tagliacampione per il sezionamento in serie del tessuto cerebrale.
Trattare le superfici superiore e inferiore del taglia tessuti. Per rimuovere la contaminazione da RNA, fissare un pezzo rettangolare di carta da filtro Watman numero quattro sulla superficie in plexiglass del tritacarne per tessuti. Fissare una lama a doppio taglio al braccio del tritacarne.
Impostare il micrometro su zero e regolare l'altezza minima del braccio del tritacarte in modo che la lametta possa tagliare la carta filtro, ma non la piastra in plexiglass. Raccogliere tutti i materiali aggiuntivi necessari per la microdissezione, inclusi piatti per colture cellulari sterili privi di RNA di dimensioni 60 per 15 millimetri, puntali per micropipetta curvi da 200 microlitri privi di RNA, forbici curve, ghiaccio secco e provette per la raccolta del tessuto. Posizionare le provette sul ghiaccio secco dopo aver decapitato un topo utilizzando una ghigliottina per roditori ed aver rimosso l'intero cervello con cervelletto e nervi ottici integri.
Posizionare il cervello nella parte superiore di una piastra per colture cellulari priva di RNAsi, di dimensioni 60 per 15 millimetri. Successivamente, trasferirlo sulla superficie di lavoro per il campionamento dei tessuti. Utilizzare una pipetta priva di RNAsi per inumidire in modo conservativo la carta filtrante attaccata al taglia-tessuti con EBSS.
Inumidire il tessuto cerebrale con EBSS. Trasferire il cervello nel tritatore di tessuti e posizionarlo con la superficie ventrale appoggiata sulla carta filtro. La linea mediana deve essere perpendicolare alla lama del tritatore e il margine rostrale del cervello deve aderire alla lama.
Utilizzare un pennello da artista trattato con A-D-E-P-C per mantenere fermo il cervello applicando una leggera pressione sulla superficie dorsale del cervello mentre lo si tiene immobile. Sollevare la leva del supporto della lama di circa quattro-cinque centimetri al di sopra della superficie del tessuto dorsale e mantenerla in questa posizione. Rimuovere il pennello dalla superficie del cervello e impostare su 750 micrometri.
Utilizzo del micrometro. Lasciare che la leva scenda, tagliando il tessuto e creando una sezione coronale di 750 micrometri mentre la lama del tritatore rimane ferma. Utilizzare un movimento rotatorio con il pennello da artista per spostare delicatamente la sezione di tessuto dalla superficie della lama.
Posizionare immediatamente la sezione del tessuto nell'EBSS ossigenato all'interno della piastra di Petri. Questa fetta è ora pronta per la microdissezione. Ripetere la procedura di taglio fino a ottenere sezioni seriali del cervello lungo tutto il piano rostro-caudale per eseguire la microdissezione.
Prima di tutto, verificare l'illuminazione per assicurarsi che l'illuminazione del campione non venga ostruita. Regolare la posizione e il flusso della miscela O2 CO2 per mantenere un ambiente tamponato e ossigenato per il tessuto. Durante la procedura, identificare la sezione cerebrale coronale che comprende la regione di interesse e, utilizzando un pennello da artista, posizionarla in piano sul fondo della piastra di Petri.
Selezionare il campione di tessuto con il diametro appropriato. Tenere ferma la sezione coronale del tessuto con il pennello da artista e posizionare la punta del campionatore di tessuto sulla superficie della sezione. Applicando pressione, spingere la punta del campionatore attraverso la sezione di tessuto fino a farla appoggiare saldamente sul fondo della piastra di Petri.
Utilizzare un movimento circolare rotatorio per assicurarsi che la regione di interesse sia stata dissociata dal tessuto circostante. Sollevare con attenzione il campione di tessuto dalla sezione e liberare il micro-punch, permettendogli di galleggiare nell'EBSS utilizzando un pennello da artista. Depositare immediatamente il micro-punch di tessuto in una provetta per conservazione stabile a meno 80 gradi Celsius, mantenuta su ghiaccio secco.
Il tessuto dovrebbe aderire facilmente alla parete del tubo. Riporre nuovamente il tubo contenente il campione microdissecato nel ghiaccio secco. Ripetere questa microdissezione per ciascuna regione cerebrale di interesse.
Una volta completata la microdissezione, registrare l'etichetta o il codice a barre di ciascun campione contenuto nei tubi. Posizionare i campioni di tessuto in un congelatore a meno 80 gradi Celsius fino all'estrazione dell'RNA per isolare l'RNA dai campioni di tessuto. Innanzitutto, preparare un'area di lavoro priva di RNA.
Preparare una quantità sufficiente di miscela di perle magnetiche e soluzione di lisi e legame, come descritto nel manuale del kit per l'isolamento dell'RNA totale. Rimuovere i campioni di tessuto dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio secco. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di lisi e legame a un tubo contenente il campione.
Collegare una bacchetta di dimensioni pari a un tubo da 0,5 millilitri priva di nucleasi al mixer per pellet e omogeneizzare il tessuto utilizzando una punta di pipetta priva di nucleasi a bassa ritenzione. Trasferire immediatamente il campione omogeneizzato in una pozzetta di una piastra per colture cellulari rotonda a 96 pozzette, utilizzando lo stesso tipo di punta. Aggiungere 60 microlitri di isopropanolo al 100% al campione.
Aggiungere 20 microlitri della miscela di perle al campione e mescolare aspirando e dispensando da tre a quattro volte con una pipetta. Seguire i passaggi del protocollo del kit per l'isolamento di RNA totale per completare l'estrazione di RNA totale. Infine, misurare la purezza e la concentrazione dell'RNA totale ottenuto. I dati provenienti da micro-prelievi di diverse regioni cerebrali sono mostrati in questa tabella.
Campioni di RNA diluiti con 30 microlitri di Buffer di eluizione hanno fornito quantità sufficienti di RNA totale per l'utilizzo con prodotti commerciali di preparazione del cDNA destinati a applicazioni di sequenziamento dell'RNA. Inoltre, il rendimento di RNA e i rapporti 260 su 280 sono valori singoli ottenuti da campioni rispettivi di microdissezione, al fine di mostrare le letture ottenute da ciascuna regione cerebrale, confermando l'elevata purezza dei campioni. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in otto-dieci minuti se effettuata correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di minimizzare il rischio di contaminazione da RNA delle superfici di lavoro o dei campioni di tessuto, utilizzando esclusivamente materiali privi di RNA o trattati con DEPC.
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Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo per il profilo dell'espressione dell'RNA in regioni cerebrali murine distinte, evidenziando una strategia precisa e ripetibile per la raccolta dei tessuti. Il metodo combina il sezionamento coronale del cervello con la microdissezione assistita da punzone tissutale per ottenere RNA totale di alta qualità.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia Molecolare
- Analisi del Profilo dell'RNA
Sfondo
- Il profilo dell'espressione dell'RNA è fondamentale per comprendere il funzionamento del cervello.
- Nuclei cerebrali discreti richiedono una dissezione accurata per un'analisi precisa.
- Il mantenimento di un ambiente privo di RNasi è essenziale per l'integrità dell'RNA.
- I metodi precedenti presentavano carenze in termini di coerenza e ripetibilità.
Scopo dello studio
- Stabilire un protocollo affidabile per l'estrazione di RNA da regioni cerebrali di topo.
- Garantire un'elevata resa e qualità dell'RNA per applicazioni successive.
- Facilitare il profilo del trascrittoma attraverso metodi migliorati di raccolta dei tessuti.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di un ambiente di lavoro privo di RNasi.
- Decapitazione ed estrazione dell'intero cervello dal topo.
- Sezionamento uniforme del tessuto cerebrale mediante un taglia tessuti azionato da micrometro.
- Microdissezione delle regioni cerebrali target utilizzando un campione di tessuto in un mezzo privo di RNA.
Risultati principali
- È stato ottenuto un alto rendimento di RNA totale dai nuclei cerebrali isolati.
- La qualità dell'RNA è stata confermata adeguata per la preparazione di librerie di cDNA.
- I risultati supportano l'utilità del metodo per il profilo del trascrittoma.
- Gli saggi hanno dimostrato una qualità sufficiente dell'RNA per applicazioni successive.
Conclusioni
- Il protocollo descritto fornisce un approccio affidabile per l'estrazione dell'RNA.
- Migliora la coerenza e la qualità dei campioni di RNA provenienti da regioni cerebrali di topo.
- Questo metodo è vantaggioso per future ricerche nel campo delle neuroscienze che prevedano l'analisi dell'RNA.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Questo approccio di microdissezione consente l'isolamento riproducibile e ad alto rendimento di RNA totale da regioni cerebrali murine distinte, affrontando un collo di bottiglia fondamentale nella validazione degli obiettivi in neuroscienze, dove bassi rendimenti di RNA ottenuti mediante microscopia a cattura laser ostacolano il profilo del trascrittoma. Fornendo un'RNA di qualità costante, idonea al sequenziamento di nuova generazione, il metodo supporta la riduzione del rischio meccanicistica dei bersagli del sistema nervoso centrale e migliora l'affidabilità predittiva nei flussi di lavoro della fase iniziale della scoperta. Si pone come alternativa scalabile ed economicamente efficiente per studi sull'espressione genica specifica di regioni cerebrali nella valutazione preclinica dei bersagli.
Applicazioni strategiche nella ricerca e sviluppo biotecnologico-farmaceutico
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando l'RNA da nuclei cerebrali specifici per correlare l'espressione trascrizionale alla funzione dei circuiti neuronali e ai fenotipi comportamentali.
- Valore operativo: Fornisce una raccolta ripetibile ed economicamente efficiente di campioni da più regioni discrete per topo, riducendo l'uso di animali e aumentando la produttività per la riduzione del rischio sui bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore Scientifico: Fornisce RNA totale con resa e purezza sufficienti per analisi a valle come RNA-Seq e qRT-PCR, consentendo lo sviluppo affidabile di saggi per lo screening dell'espressione genica in modelli di tessuto cerebrale.
- Valore Operativo: Utilizza l'isolamento dell'RNA mediante microsferette magnetiche, compatibile con protocolli ad alto rendimento, favorendo la standardizzazione tra diverse campagne di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Permette un'analisi trascrittomica rilevante per le malattie nei modelli murini, in linea con gli sforzi di scoperta di biomarcatori traslazionali nei disturbi neuropsichiatrici e neurodegenerativi.
- Valore operativo: Garantisce l'integrità dell'RNA attraverso protocolli privi di RNasi, migliorando la riproducibilità negli studi preclinici longitudinali e la comparabilità dei dati tra laboratori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto promettente, in cui il profilo dell'RNA in regioni cerebrali specifiche orienta la selezione e la priorizzazione dei bersagli prima della validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici e la riduzione del rischio biologico consentendo il confronto trascrittomico tra regioni cerebrali distinte associate a specifici circuiti neurali.
- Screening: Produce ingressi di RNA standardizzati adatti per lo screening quantitativo dell'espressione genica, migliorando la riproducibilità nei saggi di interazione con il bersaglio.
- Analisi: Genera RNA di alta qualità per la quantificazione spettrofotometrica e fluorimetrica, consentendo una normalizzazione precisa degli ingressi per applicazioni basate su sequenziamento e PCR.
- Ricerca traslazionale: Collega il profilo dell'espressione nella fase di scoperta alla continuità preclinica fornendo dati trascrittomici pertinenti alla malattia provenienti da regioni cerebrali definite.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di raccolta di tessuti e isolamento di RNA riutilizzabile, applicabile a diversi progetti nel campo delle neuroscienze e a diverse classi di bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica grazie a dati precisi sull'espressione specifica per regione cerebrale.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità mediante flussi di lavoro privi di RNasi e con un tempo minimo di manipolazione manuale (8–10 minuti per campione).
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'analisi di più campioni regionali da un singolo animale, riducendo i costi associati a metodi a basso rendimento che richiedono amplificazione.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione degli obiettivi corretta per il rischio fornendo dati affidabili sul trascrittoma per decisioni di avanzamento o interruzione nella scoperta di farmaci per il sistema nervoso centrale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in neuroanatomia e tecnica priva di RNasi per mantenere l'integrità del campione durante la dissezione e l'estrazione dell'RNA.
- Richiede l'accesso a un taglia-tessuti azionato da micrometro, a corer per tessuti di diametro fisso e a kit per l'isolamento dell'RNA basati su microsfere magnetiche.
- Necessita di protocolli standardizzati per un ambiente privo di RNasi condivisi tra i gruppi di lavoro, al fine di garantire coerenza tra studi nella qualità dell'RNA.
- L'adattamento ad altre regioni cerebrali o specie potrebbe richiedere un'ottimizzazione del diametro del campione di tessuto e dei parametri di sezionamento.
- Limite pratico: la perforazione manuale del tessuto può limitare applicazioni ad altissima produttività rispetto ai sistemi automatizzati di cattura laser, sebbene offra una resa di RNA superiore.
