Profiling di potassio voltaggio-dipendenti espressione di mRNA nei neuroni Canale nigral con singola cella di RT-PCR Tecniche

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare gli RNA messaggeri in singoli neuroni. Questo viene ottenuto mediante registrazione con patch clamp di singoli neuroni, seguita dall'aspirazione completa del citoplasma da ciascun neurone registrato, contenente l'mRNA e il citoplasma. Viene quindi sintetizzato il CDNA e amplificato mediante PCR.

In definitiva, specifici mRNA per recettori, canali ionici ed enzimi possono essere rilevati mediante un comune sistema di imaging su gel. Mi chiamo, lavoro presso il centro delle scienze della salute dell'Università del Tennessee. In generale, le persone che sono nuove a questo metodo incontreranno difficoltà perché la quantità di mRNA in un singolo neurone è estremamente ridotta e facilmente perdibile.

Iniziare questo protocollo utilizzando un vibratomo per tagliare sezioni cerebrali coronali dello spessore di 300 micrometri contenenti la parte media rostrale della sostanza nera. I cervelli possono essere isolati da ratti Sprague-Dawley di età compresa tra 15 e 40 giorni. La procedura di taglio delle sezioni viene eseguita a ghiaccio in una soluzione di taglio ad alto contenuto di saccarosio, ossigenata con una miscela di 95% di ossigeno e 5% di anidride carbonica, a un pH di 7,4. Incubare le sezioni in liquido cerebrospinale artificiale e saturare con una miscela gassosa costituita da 5% di anidride carbonica e 95% di ossigeno.

Mantenere la temperatura a 34 gradi Celsius e lasciare le sezioni per 45 minuti. Successivamente, conservare le sezioni cerebrali a temperatura ambiente fino alla registrazione. Iniziare trasferendo una sezione cerebrale in una camera di registrazione per la tecnica del patch clamp.

Continuamente perfuso con soluzione cerebrospinale artificiale ossigenata a 32 gradi Celsius. Riempire le pipette per il patch con soluzione intracellulare preparata in acqua libera da DNA e RNA, sterilizzata in autoclave. Abbassare una pipetta caricata nel bagno.

Verificare che la resistenza sia compresa tra due e tre megaohm. Innanzitutto, individuare la sostanza nera in base alla sua posizione anatomica distintiva. Quindi, utilizzando ottiche namar e un obiettivo da 60x, selezionare le cellule di grandi dimensioni nella SNC e nella SNR per la registrazione.

Questi sono possibili neuroni dopaminergici o GABAergici, senza esitazione. Utilizzare una configurazione convenzionale del whole cell con sigillo gigaohm per effettuare la registrazione in modalità clamp di corrente e clamp di tensione. Queste registrazioni in genere dovrebbero essere eseguite in meno di cinque minuti per minimizzare la degradazione dell'mRNA.

In circa un minuto, è possibile ottenere impronte elettrofisiologiche per i neuroni di interesse registrando esclusivamente le loro proprietà della membrana e di scarica. Dopo aver ottenuto i dati da un neurone di interesse, utilizzare un'aspirazione delicata con la bocca per aspirare il citoplasma. Il sigillo stretto non deve essere interrotto, altrimenti.

Detriti extracellulari, inclusi mRNA, potrebbero essere aspirati nella pipetta per il patch e contaminare il contenuto cellulare. Espellere il contenuto cellulare in una provetta PCR da 0,2 millilitri rompendo la punta della pipetta ed applicando una leggera pressione positiva. Al termine, inserire immediatamente la provetta in un congelatore a meno 20 gradi per escludere contaminazioni da detriti extracellulari che potrebbero contenere mRNA.

Preparare un controllo negativo raccogliendo il contenuto di una pipetta per patch posizionata nel tessuto senza applicare alcuna aspirazione. Subito dopo aver raccolto il contenuto cellulare da 10 a 20 neuroni, iniziare immediatamente la reazione di trascrizione inversa. Per minimizzare il degrado degli mRNA, iniziare digerendo qualsiasi DNA genomico contaminante con DNAsi per cinque minuti a 25 gradi Celsius.

Questo passaggio è fondamentale per ridurre i potenziali falsi positivi e non deve essere omesso. Successivamente, inattivare il DNA aggiungendo 1,2 microlitri di EDTA 25 millimolare e incubare i campioni a 70 gradi Celsius per cinque minuti. A questo punto, utilizzare un kit commercialmente disponibile per sintetizzare il cDNA al fine di verificare che il DNA genomico sia stato completamente eliminato.

Eseguire una reazione di controllo di ogni campione senza trascrittasi inversa. Mentre tutti gli altri componenti della reazione rimangono invariati. Conservare i prodotti a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo per la progettazione della PCR.

Primers in base alle sequenze presenti in Gen Bank, ogni volta che possibile, progettare primer che attraversino un introne per facilitare il rilevamento della contaminazione da DNA genomico. Per verificare l'efficacia delle coppie di primer, testarle su CDNA di cervello intero nella prima fase. Amplificare mediante PCR cinque microlitri dei 30 microlitri di cDNA per 35 cicli, utilizzando un protocollo standard di termociclaggio.

Per la seconda fase, eseguire l'amplificazione mediante PCR di un microlitro del prodotto della PCR della prima fase utilizzando la stessa riparazione dei primer e un profilo di ciclaggio leggermente modificato. Separare ora i prodotti su un gel di agarosio al 2,5% e visualizzarli mediante bromuro di AUM o gel verde. Sotto luce UV, asportare le bande di DNA positive e procedere al loro sequenziamento utilizzando un kit disponibile in commercio per raccogliere il DNA.

Sono state confrontate le caratteristiche elettrofisiologiche dei neuroni nella sostanza nera, pars compacta e pars reticulata. I neuroni GABAergici del SNR mostravano un'attività spontanea a frequenza più elevata, intorno a 10 hertz. Gli impulsi avevano una durata alla base di circa un millisecondo in seguito all'iniezione di corrente iperpolarizzante.

I neuroni GABAergici SNR mostravano una risposta SAG lieve, indicativa di una corrente attivata debolmente. Al contrario, i neuroni dopaminergici nigrali presentavano impulsi spontanei a bassa frequenza con una durata media di circa tre millisecondi. I neuroni dopaminergici mostravano inoltre un marcato SAG in risposta all'iperpolarizzazione, indicativo di una forte espressione della corrente IH nei neuroni GABAergici SNR, ma non nei neuroni dopaminergici.

La R-T-P-C-R a singola cellula ha rilevato l'mRNA per la glutammato decarbossilasi 1, un enzima chiave nella sintesi del GABA. Al contrario, sono stati identificati neuroni dopaminergici della SNC e della SNR, ma non nei neuroni GABAergici. La R-T-P-C-R a singola cellula ha rilevato l'mRNA per la tirosina idrossilasi, un enzima chiave nella sintesi della dopamina.

Successivamente, la R-T-P-C-R singola cellula è stata utilizzata per analizzare l'espressione dei sottounità del canale KV tre attivato dal voltaggio, che modulano le proprietà dei canali del potassio sensibili al voltaggio. Nell'esempio di neurone SNR gaba, gli mRNA per KV 3.1, 3.2, 3.3 e 3.4 sono stati rilevati soltanto in un neurone S-N-R-D-A rappresentativo. KV 3.2, 3.3 e 3.4 sono stati rilevati nei dati raggruppati.

KV 3.1 è stato rilevato più frequentemente nei neuroni GABAergici della SNR rispetto ai neuroni dopaminergici nigrali, indicando un livello di espressione più elevato di KV 3.1 nei rapidi neuroni GABAergici della SNR. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di indossare guanti e mantenere gli strumenti privi di contaminazioni dopo il loro utilizzo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare l'espressione e la funzione di recettori e canali ionici nel sistema nervoso.