Crioconservazione di embrioni di topo da glicole etilenico-Based Vetrificazione

L'obiettivo generale di questa procedura è criopreservare embrioni di topo in azoto liquido e scongelarli per ottenere topi vivi. Questo viene realizzato immergendo prima gli embrioni di topo in un mezzo di equilibrazione, trasferendoli quindi in un mezzo di vitrificazione all'interno di una provetta criogenica e infine ponendoli in un serbatoio di azoto liquido. Successivamente, gli embrioni possono essere scongelati in un mezzo ad elevata osmolarità e incubati in un mezzo di coltura fino al loro trasferimento in femmine riceventi.

In definitiva, i risultati mostrano una sopravvivenza di oltre il 90% degli embrioni dopo la devetrificazione, e tassi di natalità compresi tra il 30 e il 70% dopo il trasferimento embrionale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il crioprotettore permeabile glicole è meno tossico per gli embrioni rispetto ai crioprotettori convenzionali. A dimostrare la procedura sarà un tecnico del mio laboratorio prima di iniziare questo protocollo.

Preparare due embrioni di topo in coltura ottenuti mediante accoppiamento naturale o tecniche convenzionali di fecondazione in vitro (FIV), trasferendoli in una provetta criogenica per la successiva conservazione; aggiungere 50 microlitri di soluzione di congelamento per embrioni EF S 40. Quindi preparare una piastra di Petri in plastica da 35 millimetri o da 60 millimetri con 50 microlitri di EFS 20 a temperatura ambiente.

Utilizzare una pipetta di vetro per trasferire fino a 30 embrioni nella piastra. Avere cura di evitare il trasferimento del mezzo di coltura. Per garantire anche la disidratazione degli embrioni, posizionarli nella parte inferiore della goccia.

Dopo circa 60-90 secondi, utilizzare un capillare per aspirare gli embrioni disidratati, che presentano una morfologia ridotta. Trasferire questi embrioni nella soluzione EFS all'interno della provetta criogenica, trasferendo il minor quantitativo possibile di EFS 20.

Dopo il trasferimento degli embrioni, lasciarli assestare nell'EFS 40 per un minuto prima di congelarli in azoto liquido. Prima della scongelazione, posizionare in una piastra da coltura almeno due gocce di 10 microlitri di mezzo di coltura per embrioni ad elevata osmolarità, come il mezzo M 16. Quindi ricoprire completamente le gocce con olio siliconico o minerale e collocare la piastra in un incubatore a anidride carbonica fino all'uso.

Successivamente, riscaldare la soluzione TS one a 37 gradi Celsius indossando una maschera facciale e guanti da criogenia. Recuperare gli embrioni dal serbatoio di azoto liquido. Aprire ora rapidamente la provetta criogenica e smaltire qualsiasi azoto liquido nel serbatoio o in un contenitore appropriato.

Quindi attendere 30 secondi. Aggiungere ora 850 microlitri di soluzione TS uno calda al tubo criogenico. Aspirare e rilasciare delicatamente la soluzione circa 10 volte in modo che si sciolga uniformemente.

Quindi trasferire l'intero volume in una piastra di Petri di plastica da 60 millimetri. Oppure, su un vetrino, attendere tre minuti affinché gli embrioni si equilibrino alla temperatura ambiente, dove dovranno rimanere per il resto della procedura. Non utilizzare dispositivi di riscaldamento.

Esaminare rapidamente gli embrioni nella piastra al microscopio stereoscopico per osservarne l'aspetto all'inizio dell'incubazione. Dopo circa due minuti di incubazione, far sedimentare gli embrioni agitando delicatamente la piastra finché il mezzo non si sarà distribuito sulla superficie. Nell'ultimo minuto di incubazione, depositare tre gocce separate da 50 microlitri di soluzione TS due nella piastra.

Trascorsi i tre minuti, utilizzare un microscopio stereoscopico per verificare che gli embrioni si siano leggermente ridotti. Se gli embrioni sono ancora gonfi, proseguire l'incubazione per uno o tre minuti aggiuntivi. A questo punto, raccogliere gli embrioni con una pipetta di vetro e trasferirli alla prima goccia di TS due.

Attendere tre minuti e trasferire gli embrioni nella seconda goccia. Successivamente, trasferirli nella terza goccia. Infine, recuperare la piastra con il mezzo per embrioni preparata e conservata nell'incubatore, e utilizzare una capillare di vetro per trasferire gli embrioni nella prima goccia del mezzo.

Se osservati al microscopio stereoscopico, gli embrioni dovrebbero ripristinare lentamente la loro morfologia normale. A questo punto, rimettere la piastra nell'incubatrice per circa 10 minuti. Successivamente, lavare via il saccarosio trasferito dal TS due.

Spostare gli embrioni nella successiva goccia di mezzo di coltura. Continuare la coltura degli embrioni nell'incubatore a CO2 fino al loro trasferimento nell'utero di femmine riceventi. Dopo la vitrificazione e il recupero di tra 300 e 480 embrioni di tre ceppi diversi di topi, la sopravvivenza è stata molto elevata.

Dopo il scongelamento, la frazione di embrioni che mostravano una morfologia normale era compresa tra il 93 e il 99% e almeno l'84% di tali embrioni si sviluppava in blastocisti. Non dimenticare che lavorare con azoto in fuga può essere estremamente pericoloso e che è necessario adottare precauzioni per evitare il contatto diretto e ridurre al minimo l'esposizione a breve distanza alla fuoriuscita. L'azoto deve essere sempre manipolato seguendo questa procedura.