PDMS fabbricazione del dispositivo e la modifica della superficie

Il mio nome è Ken Kotz. Sono un ricercatore post-dottorato presso il Bio MAs Resource Center affiliato al Massachusetts General Hospital. Il mio progetto di ricerca principale prevede l'isolamento dei neutrofili mediante un dispositivo di cattura per affinità immunitaria dotato di strutture microfluidiche.

Utilizziamo questo dispositivo in cinque ospedali diversi in tutto il paese per isolare l'RNA destinato ad analisi genomiche successive. Fondamentalmente, si tratta di un master in fotoresist SU8 su silicio. Verseremo un elastomero bifasico A-P-D-M-S su questo master e il PDMS formerà uno stampo.

Rimuoviamo il modello maestro dal suo contenitore e lo posizioniamo in una piastra di Petri. Il modello viene fissato con del nastro sulla parte inferiore della piastra di Petri. Sulla bilancia pesiamo una miscela di PDMS, indurente e resina di base.

Il rapporto è di una parte di indurente a dieci parti di resina. Tipicamente, per i nostri dispositivi già ritagliati, pesiamo da 20 a 30 grammi di resina e rispettivamente da 2 a 3 grammi di indurente. Dopo aver versato sia l'indurente che la resina nel piccolo contenitore di plastica, utilizziamo una forchetta di plastica standard per mescolarli insieme.

È necessario mescolare energicamente e ripiegare la miscela su se stessa per garantire una distribuzione uniforme dell'indurente all'interno della resina. Solitamente monitoriamo l'efficacia del mescolamento osservando il numero di bolle d'aria, cercando di ottenere una distribuzione omogenea di piccole bolle d'aria in tutta la massa dell'elastomero.

Successivamente versiamo il PDMS sopra il master in SU otto che si trova nella piastra di Petri. Posizioniamo il master con il PDMS sopra di esso all'interno di un barattolo a campana sotto vuoto ed evacuiamo la camera per eliminare l'aria che abbiamo mescolato al suo interno. Tipicamente, il processo di sfiato richiede da 30 minuti a un'ora.

Dopo la degasificazione, rimuoviamo i dispositivi dalla camera a vuoto e li poniamo in un forno a una temperatura compresa tra 65 e 80 gradi C. Il tempo minimo di polimerizzazione a queste temperature è compreso tra tre e sei ore. Nel nostro laboratorio, di solito lasciamo i dispositivi in forno per tutta la notte.

Normalmente utilizziamo un bisturi in acciaio chirurgico numero 11. Effettuiamo tagli dritti verso il basso, per circa mezzo centimetro a partire dal bordo del master in silicone, e tagliamo lungo il perimetro del master per ottenere un disco di grandi dimensioni. Stacchiamo il calco in PDMS dal master e lo posizioniamo con la superficie strutturata rivolta verso l'alto in una piastra di Petri pulita.

Prendiamo il calco liberato dalla piastra di Petri e lo posizioniamo su una superficie di taglio utilizzando un coltello oppure un coltello montato su un binario lineare. Procediamo sezionando i dispositivi contenuti sul calco. Ciascun dispositivo sezionato viene quindi riposizionato nella piastra di Petri per ulteriori lavorazioni.

Normalmente, per collegare i nostri dispositivi ai fluidi, pratichiamo dei fori nel dispositivo in PDMS. Lo strumento che utilizziamo per praticare i fori è una siringa standard da tre millimetri. All'estremità della siringa da tre millimetri si trova un ago in acciaio inossidabile con punta smussata.

All'interno dell'ago in acciaio inossidabile è presente un filo che corrisponde al diametro interno dell'ago. Tale filo è collegato allo stantuffo della siringa. Tirando indietro lo stantuffo ed estraendo l'ago, è possibile perforare un foro o inserire un tappo nel PDMS. Capovolgere il dispositivo in PDMSed espellerlo spingendo lo stantuffo.

Il segreto per utilizzare i dispositivi perforatori è mantenere lo stantuffo il più verticale possibile e non ruotare affatto il dispositivo perforatore. Dopo aver perforato il PDMS, si solleva l'intero dispositivo, l'intero dispositivo in PDMS, con una pinzetta, lo si capovolge ed e si espelle il tappo premendo verso il basso lo stantuffo. Si afferra quindi il tappo con una pinzetta e lo si smaltisce.

Quindi si ritrae nuovamente lo stantuffo, si ruota il dispositivo in posizione normale e si estrae lo strumento di taglio. Si ripete questa procedura fino a quando tutti i fori sono stati perforati. Per il processo di legatura, si legano i dispositivi in PDMS a vetrini di vetro.

Per i nostri dispositivi, procederemo a legare in modo non reversibile o ad attaccare covalentemente il PDMS a vetrini di vetro. Questo viene realizzato posizionandoli in un plasma Asher ed esponendoli a un plasma di ossigeno reattivo. I passaggi per eseguire questa operazione consistono nel prendere il dispositivo in PDMS e posizionarlo sul vassoio del plasma Asher.

Con le caratteristiche del dispositivo rivolte verso l'alto, è possibile utilizzare qualsiasi vetrino microscopico standard in vetro. Noi utilizziamo un vetrino microscopico leggermente più grande, di un pollice e mezzo, per adattarlo al nostro dispositivo. È possibile utilizzarli direttamente dalla confezione.

Preferiamo trattarli con una soluzione piranha. Questo rimuove eventuali contaminanti organici che potrebbero essere presenti sulla superficie del vetrino. Dopo aver posizionato il dispositivo e il vetrino sopra il vassoio per l'ashera al plasma, si inserisce il vassoio nell'ashera al plasma ed esporre il campione al plasma reattivo di ossigeno.

Dopo il completamento del programma del plasma asher, apriamo la camera ed estraiamo la piastra con i nostri dispositivi sul banco di lavoro. Utilizzando pinzette, solleviamo con attenzione il dispositivo in PDMS, avendo cura di non toccare le superfici di incollaggio con le dita. Rivoltiamo la superficie di incollaggio verso il basso, appoggiandola sul vetrino di vetro, quindi verifichiamo che non siano presenti bolle d'aria tra il PDMS e il vetrino di vetro.

Posizioniamo il dispositivo in PDMS, ora legato al vetro, su una piastra riscaldante a 65-75 °C per 10 minuti per ottenere un legame chimico migliore. In questa sezione, procederemo alla modifica chimica delle superfici del PDMS e del vetro dopo il legame effettuato in camera bianca; al termine otterremo una superficie in PDMS con gruppi reattivi OH presenti sulla superficie. Questa superficie reattiva è idrofila e, col tempo, i gruppi OH diffonderanno all'interno della massa del PDMS.

Pertanto, la chimica superficiale viene eseguita al meglio immediatamente dopo il trattamento al plasma; utilizzeremo una soluzione al 5% di un me captolo. Si tratta di un tre me captolo, propile, trimetossi. È una soluzione al 5% in volume e, fondamentalmente, quello che facciamo è iniettarla nell'ingresso e assicurarci di riempire completamente il dispositivo senza bolle d'aria.

Se sono presenti bolle d'aria, rimuovile con una pinzetta. Una volta effettuata l'iniezione dello slan, lascialo riposare per 15-30 minuti a temperatura ambiente. Di solito, iniettiamo un secondo volume di slan 10 minuti dopo l'inizio della reazione.

Dopo che il cilindro ha reagito per circa mezz'ora, procederemo a sciacquare tutti i dispositivi con tre o quattro volumi del dispositivo di etanolo puro. L'eccesso che espelliamo verrà semplicemente rimosso con un panno chimico. Dopo il risciacquo dei dispositivi, li preleviamo e li posizioniamo su una piastra riscaldante impostata a cento gradi C, permettendo fondamentalmente all'etanolo presente di evaporare. Questo aiuta a pulire la superficie silicea.

Dopo che il dispositivo è stato asciugato, può essere conservato in un ambiente essiccato per mesi oppure si può procedere immediatamente al passaggio successivo. Dopo che i dispositivi sono stati polimerizzati, presentano un rivestimento di silano su entrambe le superfici, quella in vetro e quella in PDMS. Il silano è un aminosilano contenente un gruppo tiolo, che reagirà con il nostro crosslinker etero-bifunzionale, GMBS.

Viene diluito in etanolo puro. È reattivo all'acqua, quindi è necessario fare attenzione a non esporlo a condizioni acquose. Viene iniettato nei dispositivi e si rimuovono eventuali bolle d'aria con pinzette, come sto facendo qui, per assicurarsi che tutte le superfici siano ricoperte da questa molecola.

Lo copriamo e lasciamo reagire per mezz'ora. Dopo che il GMBS ha reagito per mezz'ora, sciacqueremo i dispositivi con acqua deionizzata per rimuovere eventuali tracce di etanolo presenti nel dispositivo. Successivamente, faremo passare neu travain, che è una proteina legante la biotina.

Il neu travain viene quindi pre-diluito a una concentrazione di 10 microgrammi per mil. Se accidentalmente viene iniettata dell'aria nel dispositivo, sarà necessario risciacquare nuovamente il dispositivo con etanolo per rimuovere efficacemente tutta l'aria; l'etanolo bagna meglio le superfici del dispositivo e consente di eliminare eventuali bolle d'aria introdotte accidentalmente. Una volta che i dispositivi sono stati risciacquati con acqua ionizzata, di solito si riempie il dispositivo con due-quattro volumi del dispositivo della soluzione diluita di neu travain neutro.

Il travain Nutt reagirà con il GMBS, che è immobilizzato sulla superficie attraverso qualsiasi mezzo primario sul travain Nutt. Questo processo può avvenire a temperatura ambiente per un'ora. In genere, pongo i dispositivi in frigorifero a quattro gradi C per tutta la notte.

Prima di aggiungere l'anticorpo, tuttavia, vogliamo eliminare qualsiasi Aden non legato presente in soluzione. Per fare ciò, facciamo passare una soluzione al 1% di BSA diluita in PBS. Poiché questi chip saranno utilizzati per analisi genomiche successive, tutte le soluzioni che utilizziamo sono prive di RNA.

Normalmente, si esegue il lavaggio del dispositivo con quattro-cinque volumi della soluzione di BSA all'1%. Successivamente, si aggiunge l'anticorpo. L'anticorpo utilizzato in questo esperimento è CD66b e anticorpi specifici per i granulociti nel sangue intero.

Utilizziamo una concentrazione compresa tra 10 e 25 microgrammi per mil e inietteremo l'anticorpo. Inietteremo 200 microlitri di anticorpo in ciascun dispositivo. Effettueremo due iniezioni di cento microlitri ciascuna, una in ciascuna porta del dispositivo.

Di solito, iniettiamo cento microlitri in una porta e attendiamo 30 minuti, quindi iniettiamo altri cento microlitri nella porta opposta.