Autologo di cellule progenitrici endoteliali-Seeding Tecnologie e test di biocompatibilità per dispositivi cardiovascolari in un modello animale di grandi dimensioni

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di seminare impianti vascolari con cellule progenitrici endoteliali derivate dal sangue autologo, quindi osservare l'effetto di questo trattamento sulla trombosi in un modello animale di grandi dimensioni. Questo viene ottenuto prelevando un campione di sangue periferico da suino per isolare le cellule progenitrici endoteliali porcine ad accrescimento tardivo. Successivamente, un dispositivo impiantabile.

Il tubo in titanio nel nostro studio di prova di principio è rivestito con le PC autologhe. Il dispositivo viene quindi impiantato nella vena cava inferiore del maiale. I risultati mostrano una protezione contro la trombosi, basata sulla pervietà del tubo in titanio rivestito con EPC, a differenza del tubo metallico nudo di controllo, che risulta occluso.

Chirurgia Duke si impegna a promuovere ricerche innovative e all'avanguardia. La seguente presentazione è un esempio di come operiamo attraverso diversi dipartimenti e discipline per far progredire la medicina. Il Dott. EK sta guidando un progetto di ricerca volto a sviluppare una tecnologia di semina cellulare che preverrà la trombosi rivestendo la superficie a contatto con il sangue dei dispositivi vascolari con le cellule progenitrici del paziente.

Dato che queste cellule sono state ottenute dagli stessi pazienti che riceveranno l'impianto, si evita il rigetto da parte del sistema immunitario. I nostri risultati e i metodi qui descritti sono il frutto di un ampio lavoro di squadra. L'impianto chirurgico sarà dimostrato da Sean Gage della sezione di chirurgia vascolare, da Whitney Lane, studentessa di medicina presso la Duke, e da me stesso.

Vorrei ora presentare Alexander Janssen, uno studente di dottorato del Dipartimento di Ingegneria Biomedica, che ci illustrerà nel dettaglio il processo di semina cellulare. Dimostrerò come seminare tubi di titanio con cellule progenitrici endoteliali ottenute dal sangue poco prima dell'impianto in un modello suino. Questo metodo rappresenta una dimostrazione di fattibilità e gli stessi principi di base possono essere applicati a molti altri dispositivi impiantabili, come ad esempio stent in nitinolo e dispositivi di assistenza circolatoria meccanica. Le EPC vengono isolate coltivando la frazione di cellule mononucleate del sangue porcino e di solito compaiono dopo circa sette giorni.

Possono essere riconosciute per la loro tipica morfologia a selciato. Espandere le EPC fino a un numero totale di 9 milioni di cellule in coltura. Lavare le EPC preparate due volte in mezzo privo di siero, avendo cura di limitare l'esposizione alla luce durante e dopo l'etichettatura.

Quindi ricoprire le cellule con un marcatore fluorescente, PKH 26, e registrare il volume di soluzione applicato. Incubare le cellule a temperatura ambiente per quattro minuti. Arrestare la reazione di marcatura aggiungendo un volume uguale di siero di suino alla soluzione di colorante un minuto dopo.

Diluire le soluzioni combinate in rapporto uno a uno con mezzo di crescita completo. Quindi aspirare il liquido e risciacquare le cellule tre volte con mezzo di crescita completo, seguito da due lavaggi con DPBS privo di cloruro di calcio o cloruro di magnesio. Successivamente, coprire le cellule con tripsina prendendo nota del volume utilizzato e incubarle a 37 gradi Celsius.

Dopo tre minuti di incubazione, utilizzare la microscopia per verificare che le cellule si siano staccate e, in caso affermativo, aggiungere una quantità doppia di soluzione di neutralizzazione della tripsina rispetto a quella aggiunta in precedenza. Combinare le sospensioni cellulari in un singolo tubo e misurare la densità cellulare mediante emocitometro. Infine, centrifugare la sospensione cellulare per formare un pellet e risospendere le cellule in almeno 4,5 millilitri di mezzo privo di siero.

Dopo aver preparato il maiale per l'intervento chirurgico, praticare un'incisione mediana con una lama da bisturi n. 15 a partire dal secondo paio di ghiandole della memoria. Procedere in senso craniale fino al penultimo paio utilizzando l'elettrocoagulazione. Portare l'approfondimento della dissezione fino alla fascia addominale.

Sollevare il peritoneo con pinze emostatiche fini e introdursi con cautela utilizzando forbici Metzenbaum, esternare la vescica urinaria e posizionare una sutura a punto stellato con Vicryl 3-0 nella parete della vescica. Praticare un'incisione centrale a punta di coltello ed inserire un catetere Foley da 16 French attraverso l'incisione. Successivamente, somministrare fluidi per via endovenosa al fine di titolare la diuresi ad almeno un millilitro per chilogrammo per ora durante l'intervento chirurgico.

Successivamente, esternare l'intestino leggermente ingrandito e posizionare due retrattori chirurgici Bour per esporre l'aspetto posteriore della cavità peritoneale e identificare la vena cava inferiore mediante dissezione affilata e ottusa. Liberare con attenzione la vena cava inferiore dai tessuti circostanti. Quindi, dissezionare il vaso dall'arteria renale destra in senso prossimale fino alla biforcazione distale della vena cava inferiore.

Massima attenzione durante la dissezione della vena cava inferiore, poiché anche un piccolo difetto nella vena cava inferiore può provocare un'emorragia rapida e l'esanguinamento dell'animale. Tutte le ramificazioni laterali del segmento della vena cava inferiore richiedono particolare cura durante la dissezione e la legatura, in particolare le due grandi vene lombari posteriori immediatamente prossimali alla biforcazione della vena cava inferiore. Spesso è presente una grande vena lombare sul lato posteriore.

Dissezionare liberamente questa vena e controllarla con anelli vascolari. Nel frattempo, parallelamente all'intervento chirurgico, iniziare a seminare l'impianto con cellule endoteliali progenitrici (EPC) prima di iniziare questa procedura. Le impalcature in titanio per l'inserimento nei tessuti devono essere completamente assemblate e pronte all'uso in un campo sterile.

Aprire l'insieme del tubo in titanio sterilizzato a gas in una siringa da cinque cc. Rimuovere quindi lo stantuffo dalla siringa da cinque cc, ma non smaltirlo. Applicare un tappo fermo alla siringa. Utilizzare una pipetta per riempire la siringa con la sospensione di EPC.

Quindi reinserire lo stantuffo. Rimuovere il cappuccio ed inserire l'estremità della siringa con l'esca all'interno del tubo di silicone aperto del dispositivo fino a quando non è ben alloggiata. Eliminare eventuali bolle avanzando lentamente la soluzione cellulare finché non raggiunge la sommità del capo.

Quindi chiudere l'assemblaggio con un tappo esca e sigillarlo con del nastro in un guanto sterile. Inserire l'intero assemblaggio in un supporto per siringhe lavorato e collocarlo in un incubatore a 37 gradi Celsius. Utilizzare un indicatore per verificare che le camere di alloggiamento siano livellate e lasciare incubare l'assemblaggio con una rotazione delicata.

Continuare l'intervento subito dopo aver legato la vena cava inferiore somministrando 100 unità di eparina per chilogrammo di peso del maiale. Quindi, applicare immediatamente un clamp sulla vena cava inferiore con un angolo di 45 gradi in posizione distale rispetto alla vena lombare e successivamente in posizione prossimale. Successivamente, utilizzare una lama di bisturi n. 11 e forbici da tessuto per praticare un'otomia venosa longitudinale di quattro centimetri tra i clamp prossimale e distale.

Svuotare qualsiasi quantità di sangue dalla vena cava inferiore (IVC) e risciacquare il suo lume interno con DPBS sterile. Inserire ora nell'IVC l'impianto con EPC posizionato o un controllo in metallo nudo per evitare che le cellule si secchino e per rimuovere l'aria. Riempire l'IVC con DPBS contenente cloruro di calcio e cloruro di magnesio.

Quindi chiudere l'otomia venosa con una sutura continua in prolene 4-0 e rimuovere una molletta prossimale per eliminare l'aria dalla VCI mediante un leggero sanguinamento retrogrado. Dopo il sanguinamento, rimuovere la molletta distale per mantenere l'impianto in posizione. Applicare una sutura di mantenimento nel tubo in PVC che attraversa la parete venosa.

Chiudere la fascia con OPDS su un ago CT. Chiudere lo spazio sottocutaneo con due punti continui in Vicryl 2-0. Quindi applicare le graffe per chiudere la cute.

Somministrare fino a 20 millilitri di Marcaine 0,25% per via sottocutanea lungo il sito dell'incisione e coprire la ferita con garza e Tegaderm per il controllo del dolore. Somministrare flu Nixon e ossimorfone per via sottocutanea secondo necessità. Interrompere l'anestesia e, quando il maiale si sveglia, riportarlo nella sua gabbia entro i successivi sette giorni.

Somministrare atri ogni 24 ore come profilassi antibiotica e assicurarsi che la patch di fentanil applicata prima dell'intervento chirurgico rimanga aderente per un totale di tre giorni. Dopo tre giorni, gli impianti tubolari in titanio posizionati sono stati rimossi ed è stata esaminata la superficie interna. A una lunghezza d'onda di eccitazione di 550 nanometri, è stato riscontrato uno strato confluenziale di cellule marcate con fluorescenza in un altro tubo.

Le sezioni cellulari sono state inoltre colorate con un marcatore di adesione tra piastrine e cellule endoteliali per visualizzare i bordi cellulari. Una vasta gamma di colorazioni può essere utilizzata in questa procedura. Al contrario, un impianto tubolare in titanio nudo si occlude completamente nell'ambiente protrombotico a basso shear rate della vena cava inferiore.

Come illustrato nelle immagini A e C, il tubo in titanio con cellule alloggiato è mostrato nell'immagine B ed è rimasto privo di coaguli dopo la nostra procedura di isolamento con picco di sangue. Le EPC compaiono dopo una media di sette giorni di coltura. Durante l'esecuzione della procedura chirurgica, è molto importante scolpire con attenzione e delicatezza la VCI, poiché anche la più piccola lacerazione della VCI o dei suoi rami laterali può portare a esanguinamento del suino. Dopo questa procedura, altri materiali a contatto con il sangue possono essere rapidamente endotelializzati per prevenire la trombosi.

Stent vascolari endoteliali, ad esempio, rivestiti con le nostre EPC imitano il rivestimento nativo della parete vascolare e potrebbero prevenire la restenosi e la trombosi dello stent dopo il suo inserimento. La nostra tecnologia Quick See permetterà di rivestire dispositivi intravascolari con cellule endoteliali progenitrici derivate dal sangue del paziente entro pochi minuti, direttamente in sala operatoria o in laboratorio di cateterizzazione. Pertanto, si evita una prolungata coltura ex vivo.

Si evita il tempo sul dispositivo stesso e la tecnologia diventa pratica per la traduzione nella pratica clinica.