Un giorno Scheme flusso di lavoro per batterica Rilevazione dei patogeni e test di resistenza antimicrobica dalle emocolture

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare e valutare la suscettibilità agli antibiotici degli isolati da emocoltura in un tempo inferiore rispetto ai metodi convenzionali. Questo viene raggiunto innanzitutto identificando l'isolato da emocoltura, mediante un innovativo saggio PCR MultiPro del DNA ribosomiale 16 s.

Successivamente, l'isolato viene incubato con un pannello di antibiotici per sei ore. Il passo successivo consiste nel determinare la crescita o l'inibizione della crescita dell'isolato in presenza dell'antibiotico, utilizzando un saggio quantitativo di PCR per il D-N-A ribosomiale 16 s. In definitiva, i risultati dimostrano che identificazione e saggio di suscettibilità agli antibiotici di un isolato da coltura ematica possono essere ottenuti più rapidamente mediante questa combinazione di coltura e PCR.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come quelli che utilizzano sistemi automatizzati phoenix o IIC, è che non richiede uno stato di coltura pregressa e che i risultati dell'identificazione e del test di suscettibilità agli antibiotici possono essere disponibili entro lo stesso giorno. La procedura sarà dimostrata da Vandy Hanson e dagli studenti del programma di dottorato in GID del nostro laboratorio. Diluire 100 microlitri di coltura ematica positiva per la crescita microbica in un tubo da reazione contenente 900 microlitri di cloruro di sodio allo 0,9%. Quindi centrifugare il campione a 13.400 ×g per cinque minuti al fine di ottenere un pellet batterico. Successivamente alla centrifugazione.

Reese, sospendere il pellet in 100 microlitri di acqua sterile demineralizzata. Conservare il campione a quattro gradi Celsius fino all'ulteriore utilizzo. Una volta pronti tutti i campioni, preparare le miscele di reazione per PCR in tempo reale per amplificare specifiche sequenze di DNA ribosomiale 16 s dai batteri di interesse.

Utilizzare acqua demineralizzata per aggiustare i volumi a 20 microlitri per reazione. Aliquotare 20 microlitri di mix PCR per pozzetto in una piastra PCR a 96 pozzetti. Successivamente, aggiungere cinque microlitri di campione in ogni pozzetto e sigillare la piastra PCR.

Successivamente, eseguire la PCR sul sistema PCR in tempo reale A BI Prism 7900 HT. Al termine della PCR, per analizzare i risultati utilizzare innanzitutto la scheda delle impostazioni di analisi per regolare il valore di CT a 0,1. Quindi, impostare l'intervallo di baseline iniziando dal ciclo 6 e terminando al ciclo 15. Registrare il valore di CT per ogni campione.

Il valore soglia per considerare un risultato di PCR positivo può generalmente essere impostato a un valore CT di 35. In questo esempio, il profilo di identificazione di una coltura ematica infetta da e coli è mostrato in due miscele di reazione. Sono stati inclusi primer universali per il DNA ribosomiale 16 s e sono state ottenute due curve di amplificazione con valori CT di 25,2 e 25,95.

La terza curva di amplificazione deriva dalla sonda specifica per Coli. Altre sonde specifiche non hanno generato segnali rilevabili. Una volta identificato il patogeno, è possibile eseguire il test degli antibiotici.

Iniziare trasferendo cinque millilitri di brodo da un'emocoltura positiva in un tubo con separatore sierico. Centrifugare il campione a 2000 ×g per 10 minuti; al termine della centrifugazione, eliminare il sopranatante dal tubo. Successivamente, utilizzando un tampone di cotone sterile, trasferire i batteri dallo strato gelatinoso del tubo in cloruro di sodio allo 0,9%, fino a ottenere una soluzione con una torbidità pari allo standard di McFarland 0,5.

Questo corrisponde a circa 1,5 volte 10 alla otto unità formanti colonie per millilitro. Successivamente, diluire la sospensione in brodo Muller Hinton a concentrazione doppia per ottenere una concentrazione di circa cinque volte 10 alla cinque unità formanti colonie per millilitro.

Aliquotare 50 microlitri per pozzetto della sospensione in una piastra microtitolata che contiene già 50 microlitri per pozzetto di una selezione di antibiotici. Assicurarsi di includere controlli positivi di crescita per ogni campione utilizzando pozzetti con acqua al posto degli antibiotici. Al termine, coprire la piastra.

Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per sei ore per consentire la crescita batterica. Assicurarsi di conservare un'aliquote della sospensione batterica a quattro gradi Celsius come controllo negativo di crescita. Dopo l'incubazione di sei ore, trasferire il contenuto di ogni pozzetto e del campione di controllo negativo in provette sterili separate.

Dopo una centrifugazione di cinque minuti a 16.000 ×g, rimuovere 80 microlitri di sopranatante e risospendere i pellet in 80 microlitri di acqua demineralizzata sterile. Diluire i campioni 1:10 in acqua prima di utilizzarli per la PCR in tempo reale del DNA ribosomiale 16S.

Preparare la miscela di PCR utilizzando la miscela superiore IQ cyber green e i primer per il DNA ribosomiale 16 s, quindi aliquotare 20 microlitri per pozzetto in una piastra PCR a 96 pozzetti. Aggiungere quindi cinque microlitri di ogni campione nei pozzetti e sigillare la piastra.

Successivamente, eseguire la PCR per analizzare i risultati. Per prima cosa, calcolare il valore CT di cutoff. In generale, il CT di cutoff è uguale al CT del controllo di crescita positivo più 0,5 volte il CT del controllo di crescita negativo meno il CT del controllo di crescita.

Tuttavia, per la pipercillina con tazobactam e CEF dazadi nei batteri a bastoncino Gram-negativi, così come per l'amoxicillina, l'oxacillina e il trimetoprim con sulfametossazolo nello stafilococco aureo o dall'amoxicillina nell'enterococco SPP, il fattore di moltiplicazione di 0,5 dovrebbe essere ridotto a 0,25. La suscettibilità o resistenza dei ceppi in ogni campione può essere determinata confrontando il CT del campione con il CT di cutoff.

Un valore CT superiore alla soglia indica suscettibilità, mentre un valore CT inferiore alla soglia indica resistenza. Di seguito è riportato un esempio di un grafico di amplificazione per la suscettibilità agli antibiotici. Il ceppo di e coli identificato in precedenza è stato testato per la sensibilità a diversi antibiotici, ognuno rappresentato da una curva separata.

Campioni con un valore CT basso sono campioni in cui si è verificata crescita in presenza di un antibiotico, indicando resistenza all'antibiotico testato. Al contrario, un valore CT elevato rappresenta un campione in cui non si è verificata alcuna crescita, indicando suscettibilità all'antibiotico testato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in nove ore se effettuata correttamente.