Visualizzazione della funzione respiratoria mitocondriale utilizzando Citocromo C Ossidasi / succinato deidrogenasi (COX / SDH) Doppio etichettatura Istochimica
23 novembre 2011
Il citocromo c ossidasi / sodio deidrogenasi (COX / SDH) doppio metodo di etichettatura permette di visualizzare direttamente mitocondriale deficit enzimatici respiratori nei fresco congelato sezioni di tessuto. Questa è una tecnica semplice istochimiche ed è utile nelle indagini malattie mitocondriali, invecchiamento e patologie legate all'invecchiamento.
L'obiettivo generale di questa procedura è consentire la visualizzazione diretta delle carenze degli enzimi respiratori mitocondriali in sezioni di tessuto fresco congelato. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo sezioni criostatiche dall'organo di interesse. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'eseguire l'istochimica della Cox, seguita dall'istochimica della SDH.
Infine, le sezioni di tessuto vengono disidratate, montate e coperte con un vetrino. In definitiva, i risultati possono mostrare il grado di disfunzione mitocondriale in base all'intensità della colorazione blu cellulare. Ciao. Oggi parleremo della tecnica istochimica di doppia marcatura Cox-SCH.
E mentre questo metodo può essere applicato per lo studio delle malattie mitocondriali, può anche fornire informazioni sull'invecchiamento e sui disturbi correlati all'età. Dopo aver rimosso il cervello da un animale sacrificato in conformità al permesso etico, congelarlo rapidamente su ghiaccio secco. Il tessuto congelato può essere conservato a meno 80 gradi Celsius, avvolto in foglio di alluminio, fino al momento del sezionamento.
Preparare il tessuto per la criosezione posizionando il cervello su un mandrino del criostato e circondandolo con un composto di inclusione. Posizionare rapidamente il mandrino nel criostato ed eseguire sezioni di 14 micron a meno 21 gradi Celsius. Scongelare le sezioni sui vetrini utilizzando un blocco riscaldante, quindi lasciare asciugare i vetrini a temperatura ambiente per un'ora.
Posizionare i vetrini in una camera per colorazione con strisce di carta umida. Poiché i tempi di reazione sono importanti in questo saggio, si raccomanda di elaborare al massimo 10 vetrini per esperimento sotto cappa chimica. Preparare l'incubazione, il mezzo contenente dab e citocromo C in PBS ed eseguire il vortex.
Aggiungere rapidamente due microgrammi di CDE bovini al mezzo e mescolare accuratamente mediante vortex. Per disperdere tutti i grumi di CDE ancora presenti sotto cappa, applicare da 150 a 200 microlitri di mezzo di incubazione su ogni vetrino utilizzando la punta della pipetta per distribuirlo uniformemente su tutte le sezioni. Incubare i vetrini per 40 minuti a 37 gradi Celsius.
Dopo 40 minuti, rimuovere il mezzo di incubazione dai vetrini. Lavare i vetrini quattro volte in PBS per 10 minuti ogni volta. Dopo il lavaggio, riposizionare i vetrini nella camera per colorazione con strisce di carta umida, operando sotto cappa chimica.
Preparare la soluzione di NBT in PBS avendo cura di proteggere il PMS dalla luce; vortexare rapidamente la soluzione. Applicare da 150 a 200 microlitri di soluzione NBT su ogni vetrino utilizzando la punta della pipetta per distribuirla uniformemente su tutte le sezioni. Incubare i vetrini per 40 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo 40 minuti, rimuovere la soluzione in eccesso dai vetrini. Lavare i vetrini quattro volte in PBS per 10 minuti ogni volta.
Disidratare i vetrini per due minuti ciascuno nelle seguenti concentrazioni sequenziali di etanolo: 70%, 70%, 95%, 95% e 99,5%. Infine, lasciare per 10 minuti in un ulteriore passaggio con il 99,5%. Posizionare i vetrini nello xilene per 10 minuti, montarli con LAN e applicare le copri-oggetti.
Lasciare asciugare i vetrini durante la notte o almeno da una a due ore in un'area ventilata qui. Sezioni cerebrali di topi di tipo selvaggio e di topi Mutator con invecchiamento precoce del DNA mitocondriale sono state etichettate in sequenza per le attività di COX e SDH.
L'attività normale della Cox, indicata dalla colorazione marrone scuro, è osservabile nell'ippocampo di topi di tipo selvaggio. Deficit di Cox, indicati dalla colorazione blu, sono stati rilevati nell'ippocampo di topi mutatori del DNA mitocondriale a 12 e 46 settimane. Si è osservato un ulteriore calo dell'attività della Cox a 46 settimane di età nei topi mutatori M-T-D-N-A, suggerendo un'ampia aggravazione della disfunzione della catena respiratoria.
Tempi di incubazione inadeguati di 10 e 25 minuti hanno determinato una ridotta deposizione del prodotto di reazione bruno della DAB. I tempi di incubazione abbreviati hanno permesso la formazione del prodotto finale blu di Foran durante l'incubazione della SDH, suggerendo in modo fuorviante la presenza di cellule con carenze di COX durante il copricampionamento. Le vetrini durante l'incubazione della COX hanno inoltre causato una formazione e una deposizione inaccurate del prodotto di reazione della DAB.
Sebbene le attività di Cox e SDH possano essere etichettate singolarmente come mostrato qui, l'etichettatura sequenziale si è rivelata vantaggiosa per individuare cellule con disfunzione mitocondriale. Un esempio di controllo della specificità per le attività COX e SDH nel cervello di un topo di tipo selvaggio mostra un'etichettatura negativa. Pertanto, non dimenticare che lavorare con i reagenti nel protocollo chimico di doppia colorazione COX-SDH comporta rischi estremamente elevati, e precauzioni come indossare un'adeguata dotazione da laboratorio e una maschera, operare sotto cappa chimica e smaltire correttamente il mezzo di incubazione devono essere adottate ogni volta che si esegue questo saggio.
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Panoramica
Il metodo di doppia marcatura citocromo c ossidasi/deidrogenasi del succinato (COX/SDH) consente la visualizzazione di carenze enzimatiche respiratorie mitocondriali in sezioni di tessuto fresco congelato. Questa tecnica istochimica è particolarmente utile per lo studio delle malattie mitocondriali e dei disturbi legati all'invecchiamento.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Chimica biochimica
- Ricerca mitocondriale
Sfondo
- La disfunzione mitocondriale è associata a numerose malattie.
- La comprensione delle carenze enzimatiche può contribuire alla diagnosi dei disturbi mitocondriali.
- Le tecniche istochimiche permettono una visualizzazione diretta dell'attività enzimatica.
- Le sezioni di tessuto fresco congelato preservano l'architettura cellulare.
Scopo dello studio
- Visualizzare carenze di enzimi respiratori mitocondriali.
- Indagare il ruolo della disfunzione mitocondriale nelle malattie.
- Fornire un metodo semplice e diretto per i ricercatori.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento di sezioni criostatiche dall'organo di interesse.
- Esecuzione dell'istochimica per la citocromo ossidasi (COX).
- Esecuzione dell'istochimica per la succinato deidrogenasi (SDH).
- Disidratazione, montaggio e copertura delle sezioni di tessuto.
Risultati principali
- I risultati indicano il livello di disfunzione mitocondriale.
- La colorazione blu cellulare è correlata all'attività enzimatica.
- Il metodo consente una chiara visualizzazione delle carenze enzimatiche.
- I risultati possono contribuire alla comprensione dell'invecchiamento e dei disturbi correlati.
Conclusioni
- Il metodo di doppia marcatura COX/SDH è efficace per lo studio della disfunzione mitocondriale.
- Questa tecnica può contribuire alla diagnosi delle malattie mitocondriali.
- Fornisce informazioni preziose sui cambiamenti mitocondriali legati all'invecchiamento.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La valutazione della funzione respiratoria mitocondriale è fondamentale per la validazione degli obiettivi nei programmi di studio delle malattie neurodegenerative e legate all'età. Il metodo istochimico con doppia marcatura COX/SDH consente una visualizzazione diretta delle carenze enzimatiche, supportando la riduzione del rischio meccanicistica dei bersagli mitocondriali. Questo approccio fornisce una previsione affidabile nella fase iniziale della scoperta, collegando l'integrità del mtDNA a letture funzionali della bioenergetica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche collegando l'attività della COX codificata dal DNA mitocondriale alla funzione della catena respiratoria.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale di bersagli mediante la rilevazione diretta dell'attività enzimatica in sezioni di tessuto con metodo istochimico.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di progetti identificando composti in grado di ripristinare i fenotipi deficitari per la COX nei modelli di malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive, stabilendo la funzione mitocondriale di base.
- Valore operativo: Fornisce dati quantitativi e risolti spazialmente sull'attività enzimatica mediante la localizzazione dei prodotti DAB e NBT.
- Riutilizzo della piattaforma: Consente una valutazione scalabile della salute mitocondriale in diversi sistemi organici utilizzando protocolli istochimici standardizzati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Si allinea a sistemi rilevanti per le malattie modellando la disfunzione mitocondriale osservata nell'invecchiamento e nei modelli di mutatore del DNA mitocondriale.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica grazie a letture riproducibili dell'attività enzimatica.
- Controllo del rischio: Orienta le decisioni di avanzamento con valutazione del rischio quantificando la disfunzione della catena respiratoria nel tempo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dal test dell'ipotesi sul bersaglio fino all'identificazione del composto promettente e alla validazione preclinica, fornendo letture funzionali delle mitocondrie.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la visualizzazione dell'attività di COX e SDH in regioni cerebrali definite.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso passaggi standardizzati di incubazione, lavaggio e disidratazione che assicurano una colorazione riproducibile.
- Analisi: Permette l'analisi comparativa tra condizioni diverse mediante la quantificazione della colorazione blu e marrone, correlata all'attività di SDH e COX.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando il peggioramento dipendente dall'età della disfunzione della catena respiratoria nei topi mutatori.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma istochimica riutilizzabile per la valutazione mitocondriale in diversi ambiti terapeutici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi terapeutici, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei modelli di malattie mitocondriali.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della visualizzazione dell'attività enzimatica tra diverse sezioni.
- Valore strategico: Decisioni più informate su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate nei programmi mitocondriali.
- Impatto sul portafoglio: Decisioni di priorità e avanzamento corrette per il rischio basate sul ripristino funzionale di cellule carenti di COX.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in istochimica e biologia mitocondriale per l'esecuzione accurata del saggio e l'interpretazione dei risultati.
- Richiede l'uso di un criostato, camere di incubazione e cappe chimiche per la preparazione dei campioni e la manipolazione dei reagenti.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i tempi di incubazione, le concentrazioni dei reagenti e i protocolli di lavaggio, al fine di evitare artefatti.
- Richiede considerazioni di adattamento quando il metodo viene applicato a tessuti non neurali, come cuore o fegato.
- Comprende limitazioni pratiche, come la manipolazione di reagenti pericolosi (DAB, NBT, PMS) e la necessità di preservare i tessuti freschi congelati.
