Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere progenie neuronali direttamente ed esclusivamente da cellule staminali embrionali umane pluripotenti mediante induzione con molecole di piccole dimensioni. Questo risultato si ottiene aggiungendo acido retinoico a cellule non differenziate mantenute in condizioni definite. Successivamente, il processo di differenziazione prosegue staccando le cellule in una coltura in sospensione, dove formano aggregati cellulari sospesi chiamati neuroblasti.

Se si permette alle neuroblaste di aderire a una piastra per colture cellulari in un mezzo di differenziamento neuronale, esse sviluppano caratteristiche di neuroni maturi. In definitiva, l'immunofluorescenza e la microscopia a deconvoluzione o confocale possono essere utilizzate per mostrare l'effetto del trattamento con acido retinoico sulla morfologia e sull'espressione dei marcatori nelle cellule staminali embrionali umane trattate. Con altre tecniche, solo una piccola frazione di cellule assume un fenotipo neuronale, mentre il nostro metodo consente un'induzione efficiente e ben controllata delle cellule staminali embrionali umane pluripotenti esclusivamente verso una linea neuronale mediante l'aggiunta semplice di piccole molecole.

Vi sono alcuni passaggi da eseguire con attenzione durante la preparazione delle soluzioni stock. Scongelare lentamente il matrigel e la laminina umana da meno 80 gradi Celsius a quattro gradi Celsius durante la notte, conservare il mezzo a quattro gradi Celsius e riscaldarlo sempre a 37 gradi Celsius prima dell'uso. Inoltre, quando si prepara il mezzo per cellule staminali embrionali umane, alcuni supplementi vanno aggiunti immediatamente prima dell'uso.

Questi includono BFGF, acido ascorbico, insulina umana attiva in A e transferrina. Successivamente, preparare immediatamente prima del rivestimento delle piastre la soluzione lavorativa di matrigel o laminina umana. Incubare le piastre a 37 gradi SIUs in presenza di 5% di anidride carbonica dopo aver preparato le piastre per colture cellulari pre-rivestite con gelatina.

La gelatina può essere sostituita dalla soluzione lavorativa di matrigel o laminina. Rivestire queste piastre incubandole tutta la notte a quattro gradi Celsius. Iniziare permettendo alle colonie di cellule staminali umane di crescere per cinque a sette giorni e quindi prepararsi a suddividerle.

Selezionare alcune colonie con oltre il 75% di cellule staminali umane indifferenziate; di solito sono leggermente opache, con bordi ben definiti e contengono cellule accumulate. Un segnale dell'inizio della differenziazione è solitamente rappresentato da colonie bianche; le colonie contenenti prevalentemente cellule differenziate appaiono invece trasparenti. Non selezionare colonie bianche o trasparenti.

Tenere le piastre alla luce e utilizzare un pennarello per delineare le colonie leggermente opache sul fondo delle piastre seguendo i contorni. Utilizzare il bordo di una punta sterile per pipetta P2 per staccare lo strato di fibroblasti circostante dalla colonia di cellule staminali embrionali umane. Rimuovere quindi i fibroblasti circostanti e tutte le parti differenziate della colonia.

Ora aspirare il vecchio mezzo contenente le cellule differenziate staccate. Successivamente, in ogni pozzetto lavare una volta le cellule indifferenziate con mezzo per cellule staminali umane E privo di BFGF, quindi aggiungere tre millilitri di mezzo fresco per cellule staminali umane contenente B-F-G-F; il B-F-G-F viene aggiunto al mezzo fresco immediatamente prima dell'uso. Ora utilizzare una punta sterile per pipetta P2 per tagliare le colonie in piccoli pezzi e staccarle dalla piastra.

Trasferire i frammenti di colonia staccati con il loro mezzo in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere un ulteriore millilitro di mezzo come risciacquo per ogni pozzetto.

Le cellule sono ora pronte per ulteriori differenziazioni mediante l'uso di molecole di piccole dimensioni. Riscaldare innanzitutto le piastre appena rivestite a 37 gradi Celsius. Aspirare la soluzione di rivestimento dalle piastre e aggiungere un'aliquote di quattro millilitri di mezzo contenente frammenti di colonie in ciascun pozzetto, quindi trasferire delicatamente le piastre nell'incubatore senza agitarle.

Non disturbare le piastre in modo che possano avvenire l'adesione. Dopo tre giorni di adesione, preparare un nuovo mezzo contenente acido omico. Quindi rimuovere la maggior parte del vecchio mezzo, lasciando solo una quantità sufficiente di mezzo perché le cellule rimangano immerse.

Le cellule non devono mai essere lasciate asciugare. Aggiungere quattro millilitri di mezzo fresco per cellule staminali umane contenente BFGF e acido rettinoico. Sostituire il mezzo ogni due giorni e lasciare crescere le colonie di cellule staminali umane trattate con acido rettinoico.

Dopo sette o otto giorni, le cellule avranno subito cambiamenti morfologici trasformandosi in grandi cellule differenziate. Procedere quindi con la preparazione di una coltura cellulare in sospensione: per iniziare la coltura in sospensione, staccare le colonie di ESL dalle cellule che si sono differenziate spontaneamente e migrate formando uno strato di fibroblasti. Utilizzare la tecnica sopra descritta con una punta di pipetta sterile, quindi aspirare il vecchio mezzo contenente le cellule di fibroblasti staccate e in sospensione.

Lavare le cellule una volta con il mezzo per hESC e ri-sospendere le cellule in tre millilitri di mezzo per hESC. Utilizzando ora una punta sterile per pipetta P2, tagliare le colonie in piccoli pezzi e staccarle dalla piastra.

Trasferire il mezzo con le colonie staccate in un singolo tubo conico da 50 millilitri. Lavare le pozzette con un millilitro di mezzo e aggiungere il lavaggio al pool. Successivamente, aliquotare quattro millilitri delle cellule raggruppate in ciascuna pozzetta di una piastra a sei pozzette con superficie ultra-bassa di adesione per quattro-cinque giorni, mantenendo la piastra in un incubatore.

In questo periodo, si formeranno aggregati cellulari galleggianti o neuroblasti che permetteranno un'ulteriore maturazione del neuroblasta verso un fenotipo neuronale più maturo. Trasferire il mezzo contenente questi elementi in un tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, centrifugare le cellule a 1.400 giri al minuto per cinque minuti.

Aspirare, pesare la maggior quantità possibile del vecchio mezzo e aggiungere una quantità uguale di mezzo NSC fresco contenente VEGF N NT three e BDNF. Sospendere le cellule mediante pipettaggio, quindi aliquotare quattro millilitri di sospensione per pozzetto in piastre per colture cellulari a sei pozzetti. Trasferire le piastre in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius.

Il neuroblastoma aderirà alle piastre di coltura per tutta la notte per una coltura 3D su Matrigel o laminina umana aggiunta alla sospensione di neuroblastomi. E una matrice 3D polimerizzerà a 37 gradi Celsius. Sostituire il mezzo ogni due giorni.

Entro due settimane, appariranno estese reti di cellule neuronali portatrici di neuriti e cellule pigmentate; l'acido retinoico risulta sufficiente per indurre le cellule staminali embrionali umane mantenute nel sistema di coltura definito a passare dalla pluripotenza esclusivamente a un fenotipo neuroepidermico. A seguito dell'esposizione di cellule staminali embrionali umane indifferenziate all'acido retinoico, tutte le cellule all'interno della colonia subiscono cambiamenti morfologici, trasformandosi in grandi cellule differenziate che cessano di esprimere il marcatore associato alla pluripotenza OCT4. Le cellule iniziano inoltre ad esprimere diversi marcatori associati al neuroectoderma, come HNK-1a, P2 e TRKC.

Queste grandi cellule differenziate hanno continuato a moltiplicarsi e le colonie sono aumentate di dimensione, esprimendo spontaneamente il marcatore neuronale precoce beta tre tubulina. Il marcatore neuronale più maturo map due ha cominciato ad apparire nelle aree delle colonie in cui le cellule si erano accumulate. Contestualmente all'apparizione delle cellule neuroectodermiche, il fattore di trascrizione neuronale specifico NER uno, implicato nella differenziazione neuronale dopaminergica e nell'attivazione del gene della tirosina idrossilasi, si è traslocato nel nucleo.

Dopo il distacco, le cellule staminali umane trattate con acido rettinoico hanno formato neuroblasti in coltura in sospensione a seguito della rimozione del FGF basico e, dopo aver permesso ai neuroblasti di aderire a una piastra per colture cellulari, sono apparse estese reti di cellule neuronali portatrici di neuriti e cellule pigmentate, tipiche del SNC, con un drastico aumento dell'efficienza, e sono state coltivate per oltre tre mesi. Queste cellule neuronali derivate da cellule staminali umane esprimevano la tubulina beta tre rispetto alla differenziazione multilineage spontanea di cellule non trattate con acido rettinoico e co-esprimevano la map due una volta acquisita la tecnica. Questa tecnica può essere utilizzata per generare progenitori neuronali in cellule neuronali in modo uniforme da cellule staminali embrionali umane pluripotenti in circa quattro settimane, se eseguita correttamente.

Non dimenticare che lavorare con cellule umane può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come assicurarsi che le linee cellulari siano prive di agenti patogeni e micoplasmi, prima di eseguire questa procedura.