Un protocollo Chelex semplice per l'estrazione del DNA da
9 gennaio 2013
Un modo rapido e conveniente per estrarre parassita della malaria qualità e il DNA da campioni di zanzara vettore è descritto. Capitalizzando proprietà chelanti di resina Chelex, il semplice metodo consente genotipizzazione dei parassiti della malaria in fasi zanzara ghiandole mid-intestinali e salivare, nonché identificazione molecolare del Anopheles Sibling specie mediante PCR.
L'obiettivo generale di questa procedura è estrarre il DNA di malaria, parassita e zanzara dalle sezioni dell'intestino medio e delle ghiandole salivari di campioni di anomalie. Questo viene ottenuto tagliando innanzitutto la zanzara esattamente all'articolazione tra l'addome e il torace, separando così l'intestino medio dalla sezione delle ghiandole salivari. Successivamente, ciascuna sezione viene macinata separatamente in acqua deionizzata.
Quindi, la sospensione tissutale viene lisata e lavata, e il pellet cellulare viene recuperato. Infine, il pellet cellulare viene ricostituito e fatto bollire, e il DNA viene estratto. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano DNA di alta qualità di zanzare e parassiti della malaria, adatto per essere utilizzato come stampo per identificare anomalie, specie di vettori e genotipizzare le infezioni malariche mediante PCR e digestione enzimatica con enzimi di restrizione specifici per alleli.
Il principale vantaggio di questa tecnica molto semplice rispetto ai metodi esistenti, come l'estrazione organica e i metodi di separazione, è che utilizza pochi reagenti sicuri e facilmente reperibili, oltre a richiedere molto meno tempo di lavorazione. Per iniziare a dissezionare la zanzara, posizionarla su un piccolo pezzo di paraform e montarla su un microscopio stereoscopico. Coprirla con una goccia di acqua deionizzata.
Per ammorbidire il tessuto e ridurne le dimensioni, effettuare un'incisione precisa sul cadavere della zanzara a livello dell'articolazione tra torace e addome, staccando così la testa e il torace dalla sezione addominale. Trasferire ogni sezione della zanzara dissezionata in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri, precedentemente etichettato con il numero identificativo della zanzara e la sezione corporea; scartare la pellicola di parafilm e, utilizzando un fazzoletto Kim inumidito con alcol al 70%, pulire attentamente il piatto del microscopio prima di passare alla zanzara successiva. Per estrarre il DNA della zanzara, pipettare innanzitutto 20 microlitri di acqua deionizzata nel tubo del campione.
E utilizzare la punta della pipetta per macinare la sezione della zanzara immersa fino a ottenere una sospensione omogenea. Aggiungere 100 microlitri di una soluzione autoclavata di XPBS 1% saponina all'omogenato del campione e mescolare delicatamente con un vortex. Incubare il campione a temperatura ambiente per 20 minuti.
Successivamente, centrifugare a 20.000 G per due minuti e scartare il soprannatante. Risospendere il pellet in 100 microlitri di PBS 1X. Quindi ripetere la centrifugazione.
Aggiungere 75 microlitri di acqua deionizzata sterile e 25 microlitri di sospensione al 20% peso/volume di resina Cellex 100 in acqua deionizzata e vortexare delicatamente per risospendere il pellet utilizzando un ago ipodermico sterile da 23 gauge, sterilizzato alla fiamma del becco di Bunsen. Praticare un foro nel coperchio del tubo del campione.
Fare bollire la sospensione del campione in un blocco riscaldante per 10 minuti. Centrifugare a 20.000 G per un minuto e trasferire la soluzione di DNA in un flacone di stoccaggio pre-etichettato per essere utilizzata come stampo nelle reazioni di PCR per verificare la qualità del DNA estratto, amplificando una regione del gene mitocondriale della sottounità quattro della nicotinammide adenina dinucleotide deidrogenasi degli artropodi, che dovrebbe produrre un frammento di 400 paia di basi. Successivamente, per differenziare tra le specie Ananais Gambia, amplificare una regione adiacente ai SNP nella regione spacer intergenica, che dovrebbe produrre frammenti di 390 paia di basi per Ananais Gambia Sensu Stricto e di 315 paia di basi per Ananais api.
Analisi quindi dei polimorfismi di resistenza ai farmaci antifolati in *P. falciparum*. Eseguire una PCR nested per amplificare la regione che comprende i codoni degli aminoacidi 16, 51, 59, 108 e 164. Nel gene della diidrofolato reduttasi dei parassiti, effettuare la digestione specifica dell'allele sull'amplicone per rilevare la resistenza ai farmaci antifolati.
Polimorfismi associati. Verificare le reazioni su un gel AROS al 2%. Esempi di risultati ottenuti con saggi PCR per l'analisi della qualità dell'estrazione del DNA da zanzare, l'identificazione molecolare di RABIS e il genotipaggio di p falciparum mostrano che il metodo Kelex semplificato produce risultati simili al protocollo standard di salting out, nonostante un numero ridotto di passaggi e meno di un quarto del tempo impiegato, con una qualità del DNA comparabile negli estratti rispettivi; non sorprende quindi che i tassi di positività dei campioni rispetto alle anomalie, alle specie sorelle di Gambia e ai tassi di infezione parassitaria non siano statisticamente diversi in base al test del chi quadrato di McNear.
L'aggiunta di BSA alle miscele di reazione determina un aumento generale dei risultati positivi nella PCR grazie alla rimozione degli inibitori della PCR, sia per il protocollo kelex semplificato che per il protocollo standard di salting out. Tuttavia, tale aumento non è risultato statisticamente significativo, ad eccezione della qualità del DNA negli estratti ottenuti con kelex. La digestione con enzimi di restrizione specifici per alleli dell'amplicone di p falciparum permette la genotipizzazione delle infezioni malariche nel midgut e nelle ghiandole salivari per gli alleli di resistenza ai farmaci, una volta acquisita la competenza.
Questa tecnica dovrebbe poter essere eseguita in circa 37 minuti se eseguita correttamente.
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo rapido ed economico per estrarre DNA di alta qualità da parassiti della malaria e da vettori zanzare. Utilizzando la resina Chelex, la tecnica consente il genotipaggio efficace dei parassiti della malaria e l'identificazione molecolare delle specie di Anopheles.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Genomica
Sfondo
- La malaria è un problema significativo di salute globale, trasmessa dalle zanzare Anopheles.
- I metodi tradizionali di estrazione del DNA possono richiedere molto tempo e necessitano di reagenti pericolosi.
- Esiste la necessità di tecniche più semplici, sicure ed efficienti per l'estrazione del DNA.
- Questo studio presenta un metodo che soddisfa queste esigenze utilizzando la resina Chelex.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo rapido ed economico per l'estrazione del DNA da parassiti della malaria e da vettori zanzare.
- Permettere il genotipaggio dei parassiti della malaria e l'identificazione delle specie di Anopheles.
- Confrontare l'efficienza e l'efficacia del nuovo metodo con i protocolli tradizionali.
Metodi Utilizzati
- Dissezione di campioni di zanzare per separare le sezioni dell'intestino medio e delle ghiandole salivari.
- Macinazione del tessuto in acqua deionizzata per creare una sospensione.
- Utilizzo della resina Chelex per l'estrazione del DNA.
- Reazione a catena della polimerasi (PCR) per il genotipaggio e l'identificazione delle specie.
Risultati principali
- Il metodo Chelex produce DNA di alta qualità adatto alla PCR.
- I risultati sono paragonabili ai metodi tradizionali con un tempo di elaborazione significativamente ridotto.
- I tassi di positività del campione per l'identificazione delle specie e le infezioni parassitarie erano statisticamente simili tra i metodi.
- L'aggiunta di BSA ha migliorato i risultati della PCR riducendo gli inibitori.
Conclusioni
- Il metodo semplificato con Chelex è efficace per l'estrazione del DNA da vettori della malaria.
- Questa tecnica può essere eseguita in meno di 40 minuti, rendendola pratica per un uso routinario.
- Offre un'alternativa più sicura e più efficiente rispetto ai metodi tradizionali di estrazione del DNA.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale per Dirigenti
In contesti con risorse limitate, il monitoraggio molecolare sostenibile di vettori e parassiti della malaria richiede metodi di estrazione del DNA che trovino un equilibrio tra prestazioni ed esecuzione semplice. Il protocollo basato sul Chelex fornisce una qualità del DNA paragonabile a quella dei metodi consolidati di salting-out, riducendo al contempo la complessità dei reagenti e il tempo di lavorazione da quasi tre ore a meno di 40 minuti. Ciò colloca questo metodo come uno strumento pratico per consentire flussi di lavoro di genotipizzazione e identificazione delle specie scalabili ed economicamente sostenibili nei programmi di ricerca e controllo nelle regioni endemiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi delle interazioni vettore-parassita fornendo template di DNA per la conferma della specie e la valutazione dello stato di infezione.
- Valore operativo: Riduce il tempo di manipolazione manuale e il consumo di reagenti, favorendo un'elevata produttività nell'elaborazione di campioni raccolti sul campo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce DNA adatto a saggi basati sulla PCR per la discriminazione delle specie vettore e il genotipaggio del parassita.
- Valore operativo: Utilizza soltanto tre reagenti (acqua deionizzata, saponina, resina Chelex), migliorando la standardizzazione dei saggi e riducendo la variabilità nei laboratori con risorse limitate.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Permette la continuità dalla raccolta dei vettori fino alle applicazioni successive, come il genotipaggio della resistenza ai farmaci mediante PCR annidata e digestione con enzimi di restrizione.
- Valore operativo: Elimina la necessità di solventi organici pericolosi, migliorando la sicurezza e l'accessibilità nei laboratori di campo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'elaborazione del campione all'analisi genetica, consentendo un input affidabile per saggi di identificazione e tipizzazione genetica basati sulla PCR.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi sulla distribuzione delle specie di vettori e sui tassi di infezione da Plasmodium falciparum in condizioni di campo.
- Screening: Fornisce estratti di DNA di qualità e resa sufficienti per applicazioni di PCR multiplex, garantendo la prontezza per i saggi.
- Analisi: Permette una valutazione quantitativa mediante amplificazione PCR del gene ND4, di SNP specifici per specie e di loci associati alla resistenza ai farmaci, consentendo il confronto tra gruppi di campioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la sorveglianza entomologica al genotipaggio del parassita, supportando decisioni mirate alla riduzione del rischio nelle strategie di controllo della malaria.
- Riutilizzo su scala organizzativa: La semplicità del protocollo e il ridotto fabbisogno di attrezzature (microcentrifuga, blocco riscaldante) ne permettono l'adozione in diversi siti di campo e tra diversi gruppi di ricerca.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce un'elevata affidabilità predittiva nell'identificazione delle specie di vettori e nel rilevamento dei parassiti, grazie a sensibilità e specificità paragonabili ai metodi di riferimento.
- Valore operativo: Garantisce un'elevata riproducibilità con minima dipendenza da reagenti, riducendo la vulnerabilità della catena di approvvigionamento in contesti remoti.
- Valore strategico: Permette decisioni più rapide di tipo sì/no nei programmi di sorveglianza, abbreviando i tempi per la conferma molecolare.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione degli interventi in base al rischio, fornendo dati tempestivi e accurati sulla competenza vettoriale e sulla prevalenza dei parassiti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede una formazione di base in biologia molecolare per la dissezione dei tessuti, l'omogeneizzazione e l'allestimento della PCR.
- Necessita dell'accesso a una microcentrifuga in grado di raggiungere 20.000 × g e a un blocco termico per il passaggio di ebollizione.
- La standardizzazione tra i gruppi di lavoro trae beneficio da tecniche di vortexing e pipettaggio costanti durante l'omogeneizzazione e la risospensione della resina.
- Un'adattamento ad altre specie di zanzare o a diversi tipi di campioni potrebbe richiedere la validazione dell'efficienza di lisi e della rimozione degli inibitori.
- Limite pratico: il metodo include un passaggio di macinazione manuale che potrebbe limitare l'automazione ad altissima produttività senza modifiche.
