Mappatura eterogeneità di espressione delle proteine ​​nei tumori mediante immunofluorescenza quantitativa

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare con precisione l'espressione di biomarcatori su sezioni intere di tessuto tumorale umano, al fine di assegnare un valore numerico al grado di eterogeneità nell'espressione proteica. Questo risultato si ottiene innanzitutto scansionando sezioni di tessuto tumorale marcate con immunofluorescenza mediante un lettore fluorescente per intere diapositive. Successivamente, vengono selezionate le regioni di interesse all'interno del tumore per la valutazione.

Successivamente, l'espressione della proteina di interesse all'interno delle aree tumorali invasive viene quantificata utilizzando il sistema automatizzato di analisi delle immagini aqua analysis. In definitiva, questo metodo può essere impiegato per mappare l'espressione dei biomarcatori nel tessuto tumorale, che spesso risulta molto eterogeneo lungo la sezione del tessuto. Il vantaggio principale dell'utilizzo di queste tecniche rispetto ai metodi tradizionali, come l'immunohistochimica con reagenti colorimetrici e di visualizzazione metrica, è che l'immunofluorescenza è più quantitativa e più sensibile.

Accoppiando questi metodi analitici a una scansione su sezione intera mediante immunofluorescenza, è possibile ottenere una mappatura dettagliata delle variazioni sottili nell'espressione dei biomarcatori nei tessuti. Per la prima volta, la dimostrazione di queste procedure è affidata a Mark Gustafson, direttore operativo diretto del laboratorio Histo RX. Dopo il taglio al microtomo di un campione bioptico di tessuto tumorale e la colorazione immunofluorescente del campione per rilevare l'espressione dei biomarcatori di interesse, caricare fino a cinque vetrini con le sezioni colorate nella cassetta portavetrini dello scanner.

Quindi, utilizzando l'interfaccia della console dello scan scope. Per ogni vetrino, selezionare una regione che comprenda tutti i tessuti presenti sul vetrino, indipendentemente dal pattern di colorazione o da altri aspetti osservabili del campione. Successivamente, utilizzando la console dello scan scope, selezionare innanzitutto una regione di tessuto da valutare, idealmente all'interno della zona tumorale del tessuto, per ottenere la rappresentazione migliore possibile.

Ora, utilizzando la funzione di esposizione automatica della console dello scan scope, determinare il tempo di esposizione per ogni canale insieme al fuoco dell'immagine; utilizzare il diamante blu nell'immagine della console dello scan scope per selezionare un'area aggiuntiva lontana dal tessuto, ma comunque all'interno della regione del vetrino sotto il coprioggetto, al fine di definire l'area di fondo dove verranno acquisite le immagini per la correzione del campo piatto. Per ciascun filtro, aggiungere punti di messa a fuoco nell'area del tessuto rappresentata dai quadrati gialli per ottimizzare l'acquisizione delle immagini. Se le immagini presentano un fondo elevato o altri artefatti, la regione dell'immagine deve essere spostata e nuove immagini devono essere acquisite.

Il tessuto viene quindi scansionato e le immagini digitali degli strisci acquisite vengono automaticamente caricate nel database Aperio Spectrum. Fare doppio clic sull'immagine in miniatura affinché il programma Spectrum selezioni lo striscio da analizzare dall'elenco degli strisci digitali presenti nel database Spectrum. Successivamente, utilizzando l'immagine annotata con h e D, annotare l'area di interesse sull'immagine fluorescente.

È possibile selezionare più aree di interesse delimitate con cerchi singoli su un singolo campione. Le immagini annotate vengono salvate automaticamente nel database degli spettri. A questo punto, quando appare la finestra di analisi, selezionare Analyze dalla barra del menu nella parte superiore dello schermo e quindi scegliere l'analisi histo RX aqua dal menu a discesa.

Quando si è pronti per iniziare, premere il pulsante di analisi. Nella barra delle applicazioni di Windows apparirà una finestra della console ridotta a icona che mostra l'avanzamento del trasferimento delle immagini dal database Spectrum al computer locale. Una volta trasferiti i dati, verrà avviata l'analisi aqua per generare un punteggio aqua mediante un algoritmo di scoring aqua non supervisionato, basato sul clustering dei dati di una prima soglia del campione, ovvero il segnale dell'immagine della pan-citocheratina superiore al segnale di fondo dell'immagine. Questo permetterà di utilizzare i pixel per definire una maschera tumorale che potrà poi essere impiegata per calcoli successivi.

Utilizzare i pixel ad alta espressione di pan-citokeratina per definire anche le regioni citoplasmatiche o non nucleari delle cellule tumorali. Come mostrato qui, i pixel con un segnale elevato nel canale DPI che si trovano all'interno della maschera tumorale vengono identificati come di natura nucleare. Se durante il controllo vengono individuati campi non adatti alla valutazione a causa di artefatti del campione o dell'immagine, tali campi vengono esclusi dalla valutazione e produrranno anche un risultato finale di fallimento.

I risultati della valutazione aqua sono rappresentati come una tabella di punteggi associati a ciascuna porzione di 512 per 512 pixel nella regione di interesse all'interno di un campione completo di sezione tessutale, che può essere salvata e utilizzata per analisi statistiche successive. Queste microfotografie colorate con ematossilina ed eosina dimostrano come diverse aree dello stesso carcinoma ovarico possano presentare una morfologia variabile. L'ingrandimento riportato in alto a destra nella Figura B evidenzia cellule con chiarificazione citoplasmatica e un modello di crescita solido nella parte superiore del tumore.

La parte inferiore del tessuto ingrandita nella sezione in basso a destra della Figura C, tuttavia, presenta un citoplasma eosinofilo più omogeneo e un pattern di crescita papillare. Qui, le mappe termiche dell'espressione di ER in una sezione di tessuto di cancro ovarico prima e dopo un trattamento chemioterapico sono mostrate rispettivamente nei pannelli superiore e inferiore. Si noti il passaggio da un'espressione variabile di ER lungo la sezione, con aree di espressione sia alta che bassa nella figura superiore, a una distribuzione uniforme di alta espressione di ER illustrata in rosso nella figura inferiore.

La rappresentazione numerica di questo cambiamento è indicata a sinistra dalla diminuzione dell'indice di Simpson. In questa figura vengono mostrate nuovamente le mappe termiche di eterogeneità di HER2 in una sezione di tessuto di cancro ovarico prima e dopo la terapia, come visibile rispettivamente nei pannelli superiore e inferiore. Si noti nuovamente il passaggio da un'espressione variabile di HER2 lungo la sezione, con aree di espressione sia alta che bassa nella figura superiore, a una distribuzione uniforme di alta espressione di HER2 nella figura inferiore.

Anche in questo caso, si osserva una diminuzione dell'indice di Simpson. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la qualità dei dati generati dall'analisi computazionale è pari alla qualità della colorazione, la quale deve rispettare un elevato standard tecnico.