Una tecnica semplificata per produrre un modello di lesione ischemica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rendere possibile la creazione di ferite ischemiche, non solo in conigli normali, ma anche in conigli con resistenza ridotta, come quelli anziani o diabetici. Tutte le tecniche attualmente utilizzate per la creazione di ferite ischemiche sono altamente invasive e, finora, nessuna di queste tecniche può essere impiegata in animali diabetici. Questa procedura utilizza un intervento chirurgico mini-invasivo che inizia con la realizzazione di tre piccole incisioni cutanee sopra i tre fasci vascolari.

Il passo successivo consiste nell'isolare e proteggere la vena centrale e il fascio vascolare coddle, in modo da ridurre la circolazione sanguigna all'orecchio senza eliminarla completamente. Infine, i vasi rimanenti, i nervi e i tessuti sottocutanei vengono tutti recisi o legati attraverso le incisioni cutanee. L'ischemia dell'orecchio viene confermata dall'assenza del polso arterioso, dall'aspetto dell'orecchio, dalla differenza di temperatura e dalla saturazione di ossigeno nei tessuti sottocutanei.

Questa chirurgia mini-invasiva può sembrare difficile da eseguire, ma in realtà è molto semplice. Il vantaggio principale di questa tecnica è che provoca un minimo disturbo della cute. Da quando abbiamo pubblicato per la prima volta questa tecnica nel 2007, abbiamo ricevuto molte domande.

Abbiamo successivamente ulteriormente semplificato questa procedura. Per renderla ancora più semplice da eseguire senza l'uso del microscopio, iniziare pesando il coniglio selezionato, anestetizzare il coniglio utilizzando una miscela di chetamina e xilazina. Monitorare i segni vitali del coniglio; sul lato dorsale possono essere identificati tre fasci vascolari che irriganano l'orecchio.

Questi sono il fascio centrale, che è il più grande e presenta collaterali che si collegano ad altri vasi; il fascio coddle, in cui l'arteria è solitamente molto piccola o assente; e il fascio craniale. Sul lato ventrale, la cute distale non riceve apporto ematico dai vasi prossimali.

Invece, i fasci vascolari del padiglione auricolare dorsale presentano numerose diramazioni penetranti attraverso la cartilagine per fornire apporto ematico alla cute ventrale distale. In alcuni conigli, si osserva anche un vaso sottocutaneo molto piccolo sul lato ventrale, che irrorra non più di un terzo della cute ventrale. In un'incisione cutanea circonferenziale aperta, essenzialmente non si verifica sanguinamento da un'incisione ventrale.

Prima di procedere, verificare che il coniglio non risponda agli stimoli dolorosi mediante una pinzatura delle dita dei piedi e il riflesso oculare; proteggere gli occhi dell'animale applicando un unguento a base di lacrime artificiali. Mantenere il coniglio al caldo durante l'intervento chirurgico utilizzando un tappetino riscaldante. Quindi, con una soluzione di Betadine e alcol, detergere entrambe le orecchie e le zone cutanee circostanti, quindi coprire il coniglio con un campo sterile in modo che solo le due orecchie siano esposte.

Un orecchio sarà reso ischemico mentre l'altro funge da controllo. Gli strumenti utilizzati per l'intervento chirurgico sono un bisturi con lama numero 15, due paia di pinze, una per la pelle e un'altra per i tessuti molli; tre pinze emostatiche, un paio o due di forbici microcurve, un paio di forbici piccole per tagliare i punti di sutura e i tessuti resistenti, un portaaiguille e alcuni punch in acciaio inossidabile.

Iniziare l'intervento chirurgico identificando i tre peduncoli vascolari in base alle arterie e alle vene. Utilizzando una lama numero 15, effettuare con attenzione un'incisione cutanea verticale sul peduncolo vascolare centrale.

Isolare la vena centrale dai tessuti circostanti e proteggerla. Questo passaggio circonda la vena centrale per la retrazione.

Dissezionare liberamente il nervo centrale. Si trova normalmente sul lato coddle della vena. Il nervo viene reciso con le forbici.

Dissezionare liberamente l'arteria centrale. Normalmente si trova sul lato craniale ed è più profonda rispetto alla vena; legare l'arteria e sezionarla. Rimuovere i tessuti intorno alla vena centrale sopra la cartilagine dell'orecchio.

Viene effettuata una seconda incisione cutanea sopra il peduncolo del coddle. Per preservare il fascio, i vasi vengono dissecati liberamente e circondati per protezione.

Questo è particolarmente utile quando la vena è di grandi dimensioni, come in questo coniglio. Creare un tunnel tra questa incisione e la prima. Recidere i tessuti sottocutanei sopra la cartilagine.

Viene effettuata una terza incisione cutanea sopra il fascio craniale. L'intero fascio viene legato e separato. La pelle sopra il terzo fascio viene incisa.

Questa vena è molto vicina alla pelle, quindi non tagliare troppo in profondità. L'intero fascio vascolare viene quindi dissezionato, legato e separato. Utilizzando un bisturi e delle forbici, creare un tunnel sottocutaneo.

I tre tagli interrompono tutti i tessuti sottocutanei, i muscoli, i nervi e i piccoli rami vascolari. Utilizzare dissezioni aggiuntive affilate e smussate per pulire la base, lasciando la cartilagine nuda larga circa cinque-dieci millimetri. L'emorragia può essere controllata mediante pressione con garza.

La cauterizzazione elettrica non è necessaria. La pelle all'interno dell'orecchio non viene tagliata poiché non presenta un ricco apporto sanguigno. L'aspetto fondamentale di questa procedura è garantire un'adeguata dissezione del tunnel sottocutaneo proteggendo al contempo i vasi.

Questa non dovrebbe essere una procedura così difficile. Dopo l'emostasi, le tre incisioni cutanee vengono chiuse utilizzando suture 4-0 o 5-0 e controllate nuovamente per assicurarsi che le incisioni siano state chiuse correttamente e che non sia presente alcun sanguinamento. Per i test farmacologici sulla ferita, quattro ferite cutanee circolari a tutto spessore possono essere create sulla faccia ventrale di ciascun orecchio mediante un punch in acciaio inossidabile da sei millimetri.

La distanza tra le ferite è di almeno 20-30 millimetri. All'interno del punch viene rimossa la pelle e il pericondrio, ma la cartilagine non viene danneggiata. Dopo aver creato le ferite su entrambe le orecchie, coprirle temporaneamente con una garza e trasferire il coniglio in una stanza per procedure per l'applicazione del farmaco.

Dopo aver rimosso dai feriti eventuali coaguli di sangue, applicare i farmaci sperimentali e di controllo. I feriti vengono coperti con una medicazione occlusiva per prevenire la desiccazione. Quando si confrontano due farmaci, applicare ciascun farmaco sia su un ferita prossimale che su uno distale.

Questo tiene conto delle diverse velocità di guarigione delle ferite nella parte distale e prossimale dell'orecchio nel periodo postoperatorio. L'orecchio ischemico di solito diventa freddo e cianotico, con una ridotta sensibilità nella zona distale all'incisione. Un lieve edema di grado I può manifestarsi per alcuni giorni, ma scompare spontaneamente e non è necessario alcun trattamento.

Il polso dell'arteria centrale è assente. Il movimento dell'orecchio è ridotto, ma non completamente eliminato perché alcuni muscoli sono ancora attaccati alla base dell'orecchio. Se il tunnel viene realizzato correttamente, si può osservare una chiara indentazione tra le incisioni.

Un cerotto al fentanil viene applicato sulla pelle della schiena per alleviare il possibile dolore postoperatorio. La temperatura della pelle viene misurata ogni giorno su ciascun orecchio con un termometro. La circolazione sanguigna nell'orecchio viene misurata utilizzando un misuratore della pressione transcutanea di ossigeno o un flussimetro Doppler a laser.

Dopo una settimana, i punti delle incisioni cutanee possono essere rimossi dal 2007. La procedura è stata utilizzata in più di 70 conigli, inclusi 23 conigli diabetici e quattro anziani.

Le differenze di temperatura tra l'orecchio non ischemico e quello ischemico variavano da uno a dieci gradi Celsius, con la maggior parte dei conigli che rientrava nell'intervallo da due a sei gradi Celsius. La differenza di temperatura era maggiore nei primi giorni dopo l'intervento chirurgico e diminuiva gradualmente dopo il giorno 15, ma risultava ancora mantenuta alla fine del primo mese. Da ciascun orecchio sono stati prelevati sei campioni di tessuto e i contenuti di fosfati ad alta energia sono stati misurati mediante HPLC, sia di ATP che di energia totale.

Le concentrazioni erano più elevate nelle orecchie normali rispetto alle orecchie ischemiche. I tempi di guarigione delle ferite erano sempre più lunghi nell'orecchio ischemico rispetto all'orecchio non ischemico negli animali non diabetici e diabetici in 15 conigli non diabetici. Il tempo medio di guarigione era di 17,8 giorni nell'orecchio non ischemico contro 21,8 giorni nell'orecchio ischemico.

In animali diabetici di 10-12 mesi, il tempo medio di guarigione è stato di 18,3 giorni sull'orecchio non ischemico rispetto a 29,1 giorni sull'orecchio ischemico. In tutti gli animali, compresi i conigli diabetici, le incisioni cutanee sono guarite normalmente senza alcuna complicazione nei conigli. Con un periodo di diabete di 24 mesi, le ferite ventrali hanno una maggiore tendenza a infettarsi.

Questa caratteristica rende la ferita più simile alle ferite diabetiche umane. Un campione di istologia mostra la guarigione del tunnel sottocutaneo in cui il muscolo è assente e viene sostituito da tessuti fibrosi. Tuttavia, la pelle è integra.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di trattare gli animali in modo umano. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora. Abbiamo utilizzato questa tecnica su più di 70 conigli, inclusi 23 conigli diabetici, senza alcuna complicazione come emorragia o infezione.

Si tratta di una procedura molto sicura se eseguita seguendo questa metodica. Altri metodi, come l'ischemia aggiuntiva, il danno nervoso e l'inoculazione batterica, possono essere effettuati per rispondere ad altre domande scientifiche, ad esempio sulle ulcere vascolari, le ulcere da pressione e la neuropatia diabetica.