A seguito di Cell-destino
14 ottobre 2011
In questo articolo viene descritta la procedura per la preparazione di una versione fluorescente marcato del batteriofago lambda, infezione di E. coli Batteri, dopo l'esito dell'infezione sotto il microscopio, e l'analisi dei risultati di infezione.
L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare un microscopio a fluorescenza per seguire il solfato in e coli in tempo reale dopo l'infezione da parte del fago lambda. Iniziare creando un lisato grezzo di fago lambda. Successivamente, purificare il fago ed infettare e coli con il fago lambda in un tubo.
Continuare a seguire il destino delle cellule batteriche al microscopio. In definitiva, i risultati possono mostrare in tempo reale diversi destini cellulari in *E. coli* attraverso l'espressione di diverse proteine fluorescenti associate alla crescita o alla morte cellulare. Generalmente, un controllo per questo metodo consiste nella creazione di una scorta purificata di fronte etichettata FI.
Per evitare la condivisione di fige durante la preparazione e la purificazione, ottimizzare anche i parametri di imaging al microscopio per consentire una crescita cellulare sana. Inoculare una coltura notturna di E 3 92 Lambda LZ one PPL star D in mezzo LBM con una densità cellulare di OD 600 pari a circa 0,6 e indurre la lisi in un bagno a 42 gradi Celsius con agitazione.
Continuare l'incubazione a 37 gradi Celsius fino a quando la lisi è evidente. La coltura diventa limpida. Aggiungere ora cloroformio al 2% e quindi incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
Successivamente, trasferire il lisato fagico in bottiglie da 250 millilitri e centrifugare la coltura. Quindi recuperare il soprannatante contenente le particelle fagiche ed eseguire una seconda centrifugazione per rimuovere i detriti visibili, seguendo protocolli standard di titolazione dei fagi. Misurare la concentrazione dei fagi, quindi purificarli mediante un gradiente al cloruro di cesio e saggia l'attività con DPI per la preparazione delle lastre aro.
Pulire sei vetrini con etanolo al 70%. Disporre cinque vetrini come mostrato e fissarli con del nastro adesivo. Versare quindi una soluzione di aros all'1,5% nel mezzo sui vetrini fissati.
Posizionare il vetrino finale in alto, facendo attenzione a evitare bolle d'aria. Apporre un peso sulla parte superiore e lasciare raffreddare l'AROS per circa 30 minuti. Rimuovere i quattro vetrini laterali e imballare il blocco di vetrini con pellicola trasparente.
Utilizzando una coltura notturna di batteri trasformati come inocolo, coltivare una coltura in LBMM, centrifugare un millilitro di batteri e risospendere. Sospendere le cellule in 20 microlitri di LBMM freddo su ghiaccio utilizzando una punta pipetta larga.
Aggiungere 20 microlitri di fago purificato. Mescolare delicatamente e incubare prima sul ghiaccio per 30 minuti per consentire l'assorbimento del fago. Successivamente, in un bagno termico a 35 gradi Celsius per cinque minuti.
Per indurre l'iniezione del DNA del fago, separare eventuali aggregati cellulari mescolando. Diluire il campione da uno a dieci in LBMM. Posizionare ora una piastra di agar LBM.
Su un'immersione, aggiungere un microlitro della miscela di fagi e cellule. Una volta assorbito, posizionare delicatamente un'altra immersione sopra. Iniziare acquisendo un insieme di immagini attraverso il canale YFP per l'intervallo temporale iniziale.
Acquisire una serie di 15 immagini a intervalli di 200 nanometri lungo l'asse Z. Inoltre, acquisire una singola immagine a fuoco attraverso i canali contrasto di fase e m cherry. Quindi, registrare un filmato in time-lapse del destino cellulare post-infezione.
Per ridurre al minimo lo sbiancamento e la fototossicità durante il filmato a intervalli, utilizzare una singola immagine in posizione Z per ogni canale per ogni punto temporale, acquisendo il campione nei canali contrasto di fase, YFP e mCherry a intervalli di 10 minuti per circa quattro ore. Iniziare l'analisi delle immagini con un conteggio manuale dei fagi, registrando anche la posizione dei fagi e la lunghezza delle cellule. Nel periodo iniziale, registrare i destini cellulari come lirici, lisogenici o non infetti.
Documentare anche il tempo di lisi e qualsiasi altra informazione desiderata riproducendo il filmato in time-lapse ed estrarre ulteriori informazioni quantitative, come il livello di fluorescenza nel tempo in singole cellule, utilizzando algoritmi automatizzati di riconoscimento cellulare e tracciamento della linea cellulare. Tipicamente, le placche dei fagi marcati con fluorescenza sono significativamente più piccole rispetto a quelle del tipo selvatico e i segnali di YFP e DAPI di un fago purificato con successo risultano co-localizzati. Questi dati combinano serie di immagini dei canali in contrasto di fase, YFP e mCherry, e le corrispondenti immagini sovrapposte provenienti da un filmato in time-lapse.
I singoli fagi sono chiaramente visibili nel periodo iniziale. Qui si osservano due cellule, ciascuna infettata da un singolo fago, e una cellula infettata da tre fagi. Tipicamente, si osserva un certo numero di fagi sulla superficie cellulare, mentre altri fagi non sono stati assorbiti.
Nel tempo, l'esito dell'infezione diventa distinguibile. Ottanta minuti più tardi, le due cellule infettate da un singolo fago hanno ciascuna intrapreso la via litica. Con la produzione intracellulare di nuovi fagi, la cellula infettata da tre fagi è entrata nella via lisogena, caratterizzata dalla produzione di mCherry dal pre-motore.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare una soluzione purificata di fagi per infettare batteri e co mediante il fago lambda ed eseguire l'acquisizione di immagini del ciclo vitale al microscopio in tempo reale.
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per la preparazione di batteriofagi lambda marcati con fluorescenza e per la loro infezione di E. coli, che consente l'osservazione in tempo reale degli esiti dell'infezione mediante microscopio a fluorescenza.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Virologia
- Microscopia a fluorescenza
Sfondo
- Il batteriofago lambda è un organismo modello per lo studio dei processi di infezione virale.
- La marcatura fluorescente permette la visualizzazione delle interazioni tra fagi e cellule ospiti.
- L'imaging in tempo reale fornisce informazioni sul destino delle cellule batteriche dopo l'infezione.
- La comprensione di queste interazioni può contribuire a ricerche più ampie in virologia e microbiologia.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per osservare l'infezione di E. coli da parte del batteriofago lambda.
- Analizzare il destino delle cellule batteriche durante l'infezione da fago mediante microscopia a fluorescenza.
- Documentare in tempo reale la dinamica dell'infezione da fago.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di un lisato grezzo del batteriofago lambda.
- Purificazione delle particelle fagiche mediante centrifugazione in gradiente di cloruro di cesio.
- Infezione di E. coli con il fago purificato e successiva analisi mediante microscopia.
- Microscopia a intervalli per monitorare il destino delle cellule batteriche e la dinamica del fago.
Risultati principali
- L'imaging in tempo reale ha rivelato destini cellulari distinti: litico, lisogenico o non infetto.
- I segnali fluorescenti hanno indicato un'infezione e replicazione fagica riuscita.
- L'analisi quantitativa dei livelli di fluorescenza ha fornito informazioni sullo stato di salute delle cellule.
- Esiti dell'infezione variavano in base al numero di fagi che infettavano singole cellule.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato permette un'osservazione dettagliata dell'infezione fagica in E. coli.
- La microscopia a fluorescenza è efficace per lo studio della dinamica virale in tempo reale.
- Le conoscenze ottenute possono contribuire alla comprensione della biologia dei fagi e delle interazioni batteriche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il monitoraggio in tempo reale del destino cellulare in E. coli dopo l'infezione da fago lambda fornisce un modello ad alta risoluzione per analizzare le decisioni binarie sul destino cellulare, fornendo direttamente indicazioni per la validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nei sistemi microbici. Questo approccio consente un'analisi quantitativa a livello di singola cellula degli esiti dell'infezione, sostenendo la previsione con maggiore affidabilità nei primi stadi della scoperta e nei punti critici di screening. La metodologia è ampiamente applicabile a team biofarmaceutici che intendono comprendere le interazioni ospite-patogeno e ottimizzare i sistemi modello traslazionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'osservazione diretta delle decisioni riguardo al destino cellulare a livello di singola cellula, chiarificando i percorsi meccanicistici.
- Consente la validazione funzionale delle target distinguendo in tempo reale gli esiti litici da quelli lisogenici.
- Facilita la riduzione del rischio biologico quantificando i parametri e gli esiti dell'infezione attraverso eventi multipli.
- Migliora l'affidabilità predittiva per l'analisi dei percorsi e la selezione dei modelli.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce letture basate sulla fluorescenza validate per flussi di lavoro di screening successivi.
- Standardizza le condizioni del saggio per misurazioni riproducibili degli esiti di infezione.
- Permette un'analisi quantitativa ad alto contenuto informativo del destino cellulare per screening di composti o genetici.
- Supporta la scalabilità e il riutilizzo della piattaforma attraverso pipeline di imaging e analisi automatizzati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea le metriche dell'esito dell'infezione a sistemi modello rilevanti per la malattia, garantendo continuità traslazionale.
- Fornisce biomarcatori quantitativi dello stato infettivo per studi di validazione preclinica.
- Consente decisioni di avanzamento aggiustate per il rischio, collegando intuizioni meccanicistiche agli esiti fenotipici.
- Supporta la riduzione predittiva del rischio nei portafogli di ricerca su microrganismi e interazioni ospite-patogeno.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo integra le fasi iniziali della scoperta fino alla selezione e alla validazione in modelli preclinici, consentendo un flusso di dati continuo e un processo decisionale senza interruzioni lungo tutta la catena di ricerca e sviluppo.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi analizzando l'esito dell'infezione a risoluzione singola-cellula.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili per lo sviluppo di saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Offre misurazioni ad alto contenuto informativo e output statistici per confrontare diverse condizioni di infezione.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica allineando gli esiti dell'infezione con la rilevanza del sistema modello.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma di imaging e analisi riutilizzabile per studi diversificati su microrganismi e interazioni ospite-patogeno.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nell'analisi del destino cellulare.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei saggi di infezione.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione (go/no-go) e l'efficienza del capitale fornendo dati robusti e quantitativi.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione e un avanzamento adeguati al rischio di programmi legati a microrganismi e infezioni.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a fluorescenza e analisi quantitativa delle immagini.
- Richiede l'accesso a piattaforme di imaging automatizzate e strumenti di analisi computazionale.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di infezione e l'elaborazione dei dati.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per ceppi batterici diversi o sistemi fagici differenti.
- Il fotoblecamento e la fototossicità devono essere gestiti durante l'acquisizione di immagini in time-lapse.
