Le analisi morfometriche delle sezioni della retina
19 febbraio 2012
Questo video mostra tre tipi di analisi morfometrica della retina, che comprendono la misurazione dello spessore interno strato nucleare, quantificare il numero delle cellule gangliari retiniche (RGC) e misurando le dimensioni delle RGC. La tecnica in grado di offrire una piattaforma semplice, ma scientifico per le analisi morfometriche.
Ciao, sono Regina del laboratorio di Malattie Neurodegenerative del Dipartimento di Anatomia dell'Università di Hong Kong. Oggi vi mostrerò come eseguire l'analisi della progressione della sessione retinica. Cominciamo. Prima di effettuare qualsiasi analisi, un campione retinico deve essere prelevato e quattro sezioni devono essere sottoposte a colorazione ematossilina ed eosina.
Successivamente, la sessione retinica viene suddivisa in quattro regioni. Sono la regione periferica superiore, la regione centrale superiore, la regione centrale inferiore e la regione periferica inferiore. Dopo aver definito le regioni, viene acquisita un'immagine di ciascuna regione a 10 volte 40 di ingrandimento mediante il microscopio a luce brillante di decor.
Ora siamo pronti ad analizzare le informazioni morfologiche retiniche. Questa sessione illustrerà come misurare lo spessore del nucleo interno della retina. Aprire il software chiamato thorough investigator.
Scegliere i 40 tipi, quindi dalla barra principale selezionare Immagine Aperta. Nella scheda File, scegliere un'immagine di una regione retinica desiderata da analizzare. Selezionare il tipo di linea di contorno dal menu a discesa della barra principale.
Assicurarsi che l'auto spostamento sia attivato. È possibile ingrandire l'immagine cliccando sul pulsante di zoom avanti. È possibile utilizzare il pulsante di zoom indietro per ridurre le dimensioni della visualizzazione dell'immagine.
Sia il tracciamento che il campione possono essere spostati lungo quattro direzioni diverse agendo sui pulsanti di movimento della causa. Fare clic con il tasto destro nella finestra di tracciamento e selezionare il tracciamento semplice della frattura. Disegnare la linea di contorno lungo il bordo interno dello strato interno.
Se si commette un errore, interrompere nel riquadro di tracciamento e premere il pulsante annulla per eliminare l'ultimo punto disegnato. Continuare il tracciamento fino all'ultimo punto della linea. Al termine del disegno, interrompere nel riquadro di tracciamento, scegliere un contorno aperto e avviare l'immagine facendo clic su zoom avanti.
Fare clic con il pulsante sinistro nella finestra di tracciamento. Per ingrandire l'immagine, selezionare un marcatore sulla barra dei marcatori due in Marcus. Nel punto di giunzione.
Dopo aver aggiunto tutti i marcatori, selezionare l'icona del marcatore nella posizione della barra del marcatore due e il cursore. Al centro di uno dei marcatori, selezionare la misurazione rapida degli angoli tramite il clic destro nel tab due nella finestra di tracciamento e quindi selezionare l'opzione continua. Misurare l'angolo cliccando prima al centro di un marcatore adiacente al marcatore selezionato.
Per un'estremità del segmento di linea, spostare il più possibile verso il centro dell'area di interesse. Marcatore e crepa. Nuovamente, estendere la linea dell'elastico fino al bordo esterno del livello inia, regolando l'angolo fino a 90 gradi.
Raggiungere la fessura sinistra al punto desiderato. Posizionare un dialogo che mostri la misura dell'angolo, che apparirà immediatamente dopo il clic. Premere il tasto Invio mantenendo il mouse fermo a sinistra.
Fare clic sulla finestra di tracciamento in modo che la linea venga disegnata da un'estremità alla nuova estremità selezionata. Interrumperla nella finestra di tracciamento e scegliere un controllo aperto. Dobbiamo effettuare quattro misurazioni dei prolungamenti del nucleo interno in ciascuna regione, dove verranno disegnate quattro linee.
Perpendicolarmente dalla base di controllo notturna fino al margine esterno del strato nucleare interno e avviare l'immagine in modo da poter vedere chiaramente il bordo. Se l'estremità della linea non si trova all'esterno del strato nucleare interno, è possibile estenderla o accorciarla in modalità modifica. Selezionare la modalità di modifica e scegliere la linea.
Fare clic sulla finestra di tracciamento e scegliere un punto di ricerca nel controllo elettrico, aggiungere un punto al bordo esterno mentre la modifica del punto deve avvenire lungo la stessa linea. Eliminare il punto originale. Un allineamento con un nuovo sollevamento può quindi essere ottenuto.
Ridurre il lato dell'immagine facendo clic sul pulsante di zoom indietro. Deselezionare la modalità di modifica e disegnare l'ultimo segmento di linea. Dopo aver disegnato le linee d'ordine, selezionare la modalità di modifica.
Fare clic con il tasto destro sulla finestra di tracciamento e posizioniamo i quattro segmenti di linea di conseguenza. Ora possiamo ottenere le quattro misurazioni premendo il pulsante di misurazione CONT. Selezionare queste quattro misurazioni e incollarle a un esperto cliccando su copia.
Per fare clic sulla sfera, selezionare "Salva come" sotto la scheda File. I dati di tracciamento possono essere salvati come file di dati. In questa parte, quantificheremo il numero di cellule Gagan a coda rossa; selezionare l'immagine da aprire.
Sotto la scheda file, scegliere un'immagine di una regione retinica desiderata da analizzare. Prima di tutto, dobbiamo identificare quali sono le cellule vitali e quali quelle morte. Le cellule con una forma approssimativamente regolare, in cui si osserva chiaramente un nucleo ben definito, vengono considerate cellule gangliari retiniche vitali.
Si considerano tali cellule quelle che sono piccole e condensate. Scegliere il tipo di linea di contorno dal menu a discesa della barra principale. Tracciare una linea lungo il bordo del livello di fibre sinistro e seguire con l'opzione e il contorno aperto.
Aggiungere a ogni estremità un marcatore all'estremità della linea e l'altro in prossimità della squadra. Selezionare l'icona del marcatore nella barra marcatore due. Posizionare il cursore al centro dei marcatori.
All'estremità, selezionare la misurazione rapida degli angoli nella scheda. Fare clic con il tasto destro due volte nella finestra di tracciamento e selezionare l'opzione continua, quindi utilizzare le linee elastiche per misurare un angolo di 19 gradi. Premere il tasto Invio subito dopo che un quadratino è stato acquisito.
Ricordare però che il mouse è ancora contemporaneamente attivo. Interrompere la finestra di tracciamento in modo che una nuova linea possa essere estesa in particolare dalla punta. Interrompere nella finestra di tracciamento e selezionare un controllo aperto.
Tracciare un'altra nuova linea esattamente nello stesso modo dell'altra estremità. Abbiamo creato due delimitazioni entro le quali viene contato il numero di cellule ratin gagan. Selezionare un tipo di marcatore e applicarne uno a ogni cinque cellule.
Scegliere un confine come linea di esclusione, che la cellula tocca ma che non è attiva. Selezionare un altro tipo di marcatore per le cellule morte. Il numero di ciascun tipo di spazio marcato verrà visualizzato accanto all'icona del marcatore. Di conseguenza.
Nella barra del marcatore due, selezionare la modalità di modifica e selezionare la linea di base del contorno. Interromperla nella finestra di tracciamento e riposizionare la fine della linea. Il nome della linea di base del contorno può essere ottenuto premendo il pulsante di misurazione del contorno.
Il numero delle cellule può quindi essere espresso per millimetro del nome. Salviamo dunque tramite la scheda file. I dati di tracciamento e del marcatore possono essere salvati come file di dati.
In questa parte verrà illustrato come misurare il lato cellulare di un'immagine selezionata di cellula gangliare retinica. Nella scheda file, scegliere un'immagine di una regione retinica desiderata da analizzare. Selezionare una cellula gangliare retinica vitale in base ai criteri descritti nella parte precedente.
Nella cellula vivente, scegliere il tipo di linea di contorno a partire dal punto iniziale delle due barre principali. Tracciare una linea di contorno lungo la circonferenza della cellula, quindi fare clic con il tasto destro nella finestra di tracciamento e selezionare "Fine contorno chiuso". L'area della cellula verrà visualizzata sotto la voce Area nella finestra di dialogo Controllo misurazione.
Questo video ha dimostrato tre semplici metodi che possono analizzare in modo oggettivo la retina. Speriamo che questo video sia utile.
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Panoramica
In questo video vengono dimostrate tre tipologie di analisi morfometriche della retina, inclusa la misurazione dello spessore dello strato nucleare interno, la quantificazione del numero di cellule gangliari della retina (RGC) e la misurazione delle dimensioni delle RGC. La tecnica fornisce una piattaforma scientifica per queste analisi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Morfometria retinica
- Quantificazione cellulare
Sfondo
- La salute della retina è fondamentale per la visione.
- Le analisi morfometriche aiutano a comprendere le malattie retiniche.
- I neuroni gangliari retinici sono essenziali per la trasmissione delle informazioni visive.
- La misurazione dei neuroni gangliari retinici può fornire informazioni sulle condizioni neurodegenerative.
Scopo dello studio
- Dimostrare tecniche morfometriche per l'analisi della retina.
- Quantificare le cellule gangliari retiniche e le loro dimensioni.
- Misurare lo spessore del strato nucleare interno.
Metodi Utilizzati
- Preparazione dei campioni retinici.
- Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E).
- Divisione della retina in regioni definite per l'analisi.
- Acquisizione delle immagini a diverse ingrandimenti.
Risultati principali
- Misurazione accurata dello spessore del lamina nucleare interna.
- Quantificazione delle cellule gangliari retiniche.
- Valutazione delle dimensioni delle cellule gangliari retiniche in diverse regioni della retina.
- Dimostrazione di un approccio sistematico per la morfometria retinica.
Conclusioni
- Le tecniche presentate sono efficaci per l'analisi della retina.
- Questi metodi possono contribuire alla comprensione delle patologie retiniche.
- Studi futuri possono basarsi su questo approccio per ulteriori ricerche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi morfometrica oggettiva delle sezioni retiniche consente una quantificazione precisa della perdita neuronale e dei cambiamenti strutturali, supportando la validazione degli obiettivi nei modelli di malattie neurodegenerative. Riducendo la variabilità delle misurazioni e aumentando la sensibilità ai cambiamenti minimi, questo approccio migliora la fiducia predittiva nella valutazione dell'efficacia terapeutica. Fornisce una piattaforma traslabile per valutare le patologie retiniche in tutte le fasi della scoperta di farmaci.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando le alterazioni della densità delle cellule gangliari retiniche e delle dimensioni del soma nei modelli di malattia.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante misurazioni riproducibili dello spessore del strato nucleare interno e della morfometria dei strati cellulari.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio studi fornendo dati morfometrici assoluti e riproducibili per il confronto tra diversi studi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi mediante protocolli standardizzati di acquisizione delle immagini e tracciamento basati su regioni.
- Output quantitativo: Genera misurazioni assolute di lunghezza e dimensione direttamente esportabili in file analitici, migliorando la coerenza dei dati.
- Scalabilità: Permette una valutazione affidabile dei composti grazie alla riduzione della variabilità dell'osservatore e a una maggiore sensibilità nel rilevare modifiche minime della retina.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Si allinea alle strategie traslazionali di biomarcatori collegando la perdita delle cellule gangliari retiniche e le variazioni dello spessore dei livelli ai risultati terapeutici nei modelli di glaucoma e di eccitotossicità.
- Continuità preclinica: Supporta decisioni di avanzamento con rischio calibrato attraverso endpoint morfometrici oggettivi e ripetibili in diverse regioni retiniche.
- De-risking meccanicistico: Si concentra sulla valutazione predittiva isolando i cambiamenti strutturali indipendentemente dai saggi funzionali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino all'identificazione del composto leader e alla valutazione preclinica, fornendo letture strutturali che integrano le valutazioni funzionali nei modelli di malattie retiniche.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi quantificando il numero di cellule, la dimensione e lo spessore degli strati in regioni retiniche definite.
- Screening: Garantisce prontezza e riproducibilità del saggio mediante l'analisi standardizzata di sezioni colorate con ematossilina ed eosina (H&E) e tracciamento guidato da software.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative di variabili dipendenti (conteggio cellulare, dimensione del soma, spessore dello strato), consentendo confronti statistici tra gruppi sottoposti a diversi trattamenti.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso endpoint strutturali rilevanti per la malattia nei modelli di eccitotossicità indotta da NMDA, ischemia-riperfusione e glaucoma.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile di morfometria retinica in diversi modelli di malattia e interventi terapeutici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella neurodegenerazione retinica.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità delle misurazioni morfometriche tra diversi operatori e sedi.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, maggiore efficienza nell'uso del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate grazie al rilevamento precoce di biomarcatori strutturali.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate su modifiche strutturali retiniche quantificabili.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze richieste in istologia, microscopia e utilizzo di software morfometrici (Stereo Investigator).
- Le attrezzature necessarie includono un microscopio a campo chiaro, un sistema di tracciamento computerizzato e un software di analisi delle immagini.
- La standardizzazione tra gruppi diversi richiede l'aderenza al protocollo per la definizione delle regioni, la tecnica di tracciamento e la ripetizione delle misurazioni.
- Le considerazioni per l'adattamento tra diversi sistemi modello includono la regolazione dell'ingrandimento, del campionamento delle regioni e dei criteri di identificazione cellulare.
- I limiti pratici comprendono la dipendenza dalla qualità dei tagli istologici e dalla costanza della colorazione per una corretta delimitazione dei bordi.
