Monitoraggio Attività chinasi e fosfatasi attraverso il ciclo cellulare da raziometrica FRET

In questo video, le attività delle chinasi e delle fosfatasi vengono monitorate durante il ciclo cellulare utilizzando il trasferimento di energia per risonanza di Forster o FRET. Qui, una sonda per l'attività della chinasi tipo polo uno o PLK1 presenta la proteina fluorescente ciano (CFP) posizionata a un'estremità e la proteina fluorescente gialla (YFP) posizionata all'altra estremità. Questa sonda viene trasfettata in cellule U2 OS.

Quindi, per esaminare lo stato di fosforilazione di LK che è bersaglio durante la transizione da G2 a M, le cellule U2 OS transfezionate vengono sottoposte a imaging fluorescente a intervalli di tempo. Quando CFP e YFP sono in prossimità e CFP viene eccitato, l'energia viene trasferita a YFP e può essere rilevata l'emissione di YFP. Tuttavia, quando la sonda viene fosforilata, un cambiamento conformazionale nella proteina separa CFP e YFP.

Ora, quando il CFP viene eccitato, si rileva una forte emissione del CFP e solo una debole emissione del YFP; la quantificazione del rapporto tra l'emissione del YFP dopo eccitazione sia del CFP che del YFP dimostra che l'attività della PLK1 aumenta in G2 e raggiunge il massimo durante la mitosi. Pertanto, il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la comune microscopia time-lapse, consiste nel fatto che si presta particolare attenzione affinché il ciclo cellulare non venga perturbato né dalle condizioni di acquisizione né dall'espressione della sonda. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del ciclo cellulare, come dove e quando specifiche chinasi o fosfatasi vengono attivate.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sugli enzimi regolati dal ciclo cellulare, può essere applicato anche ad altri sistemi in cui sono necessarie condizioni non risolutive, come nei saggi di proliferazione cellulare. Per monitorare il ciclo cellulare umano, le cellule U2 OS vengono trasfettate con una sonda basata sul trasferimento di energia per risonanza (FRET) per l'attività della PKA. Utilizzando un metodo standard di trasfezione con fosfato di calcio, le cellule vengono selezionate in presenza di puromicina per almeno sette giorni.

Questo arricchisce la popolazione di cellule che esprimono la sonda e limita il numero di cellule con livelli di espressione tossici o livelli di espressione che influenzano gravemente il ciclo cellulare. Le linee cellulari stabili vengono quindi selezionate mediante diluizione limitata; l'espressione di CFP e YFP viene quindi analizzata per verificare che entrambe siano presenti in tutte le cellule in un rapporto approssimativamente costante. Se alcune cellule contengono solo CFP o YFP, è probabile che si sia verificata una ricombinazione; in tal caso, ripetere la preparazione del plasmide utilizzando batteri meno soggetti a ricombinazione omologa, come ad esempio i ceppi Sure; quindi linearizzare il plasmide e ripetere la trasfezione.

Una volta che le cellule esprimono stabilmente la sonda, seminarle in piatti con fondo in vetro numero 1,5 dopo che si sono attaccate e hanno raggiunto una confluenza del 30-50%. Cambiare il mezzo con uno indipendente da CO2 e privo di rosso fenolo, quindi montare le cellule su un microscopio a fluorescenza episcopica motorizzato con controllo della temperatura impostato a 37 gradi centigradi. Il microscopio deve essere dotato di filtri di eccitazione ed emissione per CFP e YFP.

Uno specchio ROIC adatto per monitorare CFP e YFP e un obiettivo adatto alla risoluzione richiesta. In questo caso, viene utilizzato un obiettivo da 20x NA 0,75 ad aria. Utilizzando la luce trasmessa, mettere a fuoco le cellule.

Non utilizzare luce fluorescente in questo momento, poiché indurrebbe una risposta da stress che potrebbe alterare il ciclo cellulare. Per evitare la fototossicità, impostare la curvatura al valore massimo disponibile che consenta la risoluzione sottocellulare richiesta. Per questo esperimento, dovrebbe essere possibile distinguere il nucleo e il citoplasma.

Impostare un tempo di esposizione breve e inserire un filtro neutro ad alta densità. Quindi acquisire un'immagine di prova a 12 o 16 bit utilizzando l'eccitazione e l'emissione di YFP; regolare il tempo di esposizione e i filtri neutri in modo che l'intensità media all'interno di una cellula sia approssimativamente uguale all'intensità di fondo più cinque volte la differenza tra le intensità di fondo minima e massima. Per verificare che le immagini non siano saturate, esaminare l'intensità della fluorescenza nell'immagine del campione.

L'intensità massima nell'immagine dovrebbe essere inferiore alla metà della gamma dinamica per consentire differenze di intensità quando le cellule entrano in mitosi. Successivamente, ripetere questo processo utilizzando i filtri di eccitazione CFP e di emissione YFP. Selezionare più regioni con cellule trasfettate, escludendo le regioni utilizzate per la messa a fuoco e l'ottimizzazione delle condizioni di esposizione.

Poiché queste procedure potrebbero aver innescato una risposta da stress, assicurarsi che l'intensità massima sia inferiore alla metà della gamma dinamica in tutte le cellule. Impostare il software per acquisire due immagini ogni 45 minuti utilizzando l'eccitazione YFP, l'emissione YFP e l'eccitazione CFP. Filtro per l'emissione YFP.

Impostare inoltre la durata totale dell'esperimento in modo che superi la durata del ciclo cellulare. Una volta effettuate tutte le impostazioni, iniziare l'acquisizione delle immagini; al termine dell'acquisizione, aprire le immagini ottenute e monitorare il tempo del ciclo cellulare dalla mitosi alla mitosi. Per le cellule che esprimono la sonda trasfettata qui, il tempo del ciclo cellulare era approssimativamente compreso tra 20 e 25 ore.

Confrontare questi dati con i dati di controllo per il tipo cellulare utilizzato. Se il tempo del ciclo cellulare corrisponde ai tempi di riferimento, l'FRET può essere analizzato. Una volta verificata la tempistica, le immagini possono essere analizzate.

L'analisi può essere eseguita con la maggior parte del software dedicato alla microscopia. In questo caso, si utilizza il software gratuito Image J con il plugin Ratio Plus. Iniziare l'analisi aprendo le immagini in Image J. Se le immagini sono in formato di stack multicolore, separare i singoli canali convertendoli in uno stack iper immagine selezionando immagine.

Quindi iperpila, quindi pila in iperpila. Si apre la finestra di conversione in iperpila con le impostazioni visualizzate; fare clic su OK. L'immagine verrà ora visualizzata con due barre di scorrimento al di sotto.

Per dividere successivamente le immagini in stack a canale singolo, fare clic sull'immagine e selezionare "riduci dimensionalità iperstack". Verrà aperta la finestra di riduzione; assicurarsi che siano selezionati frame e mantieni sorgente. Quindi fare clic su OK.

Apparirà una nuova immagine contenente un solo canale. Ripetere questo processo per ottenere una nuova immagine con il secondo canale. Successivamente, per aumentare la chiarezza visiva delle immagini finali, selezionare lo stack di eccitazione YFP e di emissione YFP.

Fare clic su "processo", quindi su "matematica". Successivamente, selezionare la funzione di moltiplicazione. Quando si apre la finestra di moltiplicazione, inserire il valore tre per moltiplicare lo stack di emissione YFP eccitato da YFP per tre. Questo passaggio è facoltativo e garantisce che i rapporti non rientrino nell'intervallo compreso tra zero e uno.

Successivamente, sulla barra degli strumenti dell'immagine J, selezionare lo strumento a mano libera. Quindi, nello stack di eccitazione YFP e di emissione YFP, disegnare una regione di interesse o ROI in un'area priva di cellule, ma vicina a una cellula che verrà misurata. Per aggiungere la ROI al gestore delle ROI, fare clic su strumenti di analisi, quindi su gestore ROI.

Apparirà la finestra del gestore delle aree di interesse (ROI). Fare clic su aggiungi per salvare le coordinate dell'area di interesse al fine di misurare l'intensità media dell'area di interesse nella serie di immagini con eccitazione YFP ed emissione YFP. Fare clic su analizza, quindi selezionare misura.

Si aprirà la finestra dei risultati. Selezionare lo stack di eccitazione CFP ed emissione YFP. Quindi fare doppio clic sull'area di interesse (ROI) nel gestore ROI e ripetere la misurazione.

La misurazione viene aggiunta alla finestra dei risultati. Scorrere verso altre posizioni nella serie per ripetere questo processo in diversi punti temporali. Verificare che le intensità di fondo vicine alla cellula di interesse siano simili per tutta la durata del filmato confrontando le misurazioni nella finestra dei risultati.

Per impostare le misurazioni includendo l'intensità minima, fare clic su Analizza, quindi su Imposta misurazioni e indicare il valore minimo e massimo di grigio. Verrà visualizzata una finestra con le alternative di misurazione. Dopo aver regolato luminosità e contrasto secondo necessità, disegnare un'area di interesse (ROI) che copra la maggior parte di una cellula e misurare l'intensità minima in entrambi gli stack.

Quindi effettuare le misurazioni come in precedenza, utilizzando questa volta una cellula invece dello sfondo. Utilizzando i valori delle sezioni dei risultati, calcolare la differenza tra l'intensità minima misurata e l'intensità dello sfondo e dividerla per due. Questo fornisce una stima iniziale per un valore di soglia per aprire il rapporto più selezionare i plugin.

Quindi ratio plus. Successivamente, per il ratio FRET, selezionare lo stack S di eccitazione CFP ed emissione YFP uno oppure, per il ratio FRET invertito utile alla visualizzazione di sonde in cui l'efficienza FRET diminuisce in seguito a fosforilazione, selezionare lo stack S di eccitazione YFP ed emissione YFP uno per inserire i valori misurati di intensità di fondo e i valori di clipping.

Utilizzare i valori della finestra dei risultati e incollarli nella finestra del rapporto (ratio plus). Impostare la scala del tracciato risultante del rapporto e applicare una tabella di consultazione (lookup table) appropriata per visualizzare le variazioni del rapporto. Le cellule U2 OS che esprimono una sonda basata sul FRET per il monitoraggio dell'attività della PLK1 sono state filmate per 60 ore come descritto in questo video.

Questa immagine mostra l'ingresso mitotico cumulativo di 50 cellule che esprimono la sonda fret, inclusa la divisione delle cellule figlie. La maggior parte delle cellule che esprimono la sonda si proliferano con un tempo del ciclo cellulare compreso tra 20 e 25 ore, indicando che le condizioni di imaging e i livelli di espressione della sonda non influenzano la tempistica del ciclo cellulare. Una rappresentazione a colori falsati del rapporto fret invertito, seguito in una cellula attraverso quattro divisioni, dimostra che, nonostante il rumore considerevole, si osserva una tendenza in cui l'attività di PK uno aumenta in G due e raggiunge il picco durante la mitosi.

Quando i dati grezzi vengono filtrati per media e presentati come grafico, è facile stimare l'intervallo di tempo tra i picchi di attività. Questa figura mostra la quantificazione del rapporto FRET invertito della cellula mostrata nelle immagini precedenti, ricavata dal grafico. È possibile stimare il momento dell'attivazione e, come si può osservare qui, la fosforilazione della sonda diventa visibile circa quattro ore prima che la fosforilazione raggiunga il massimo in mitosi.

Nel corso di questa procedura, è importante mantenere le cellule in condizioni di assenza di stress; a tal fine, si deve ridurre al minimo l'esposizione alla luce, nonché le variazioni di temperatura o pH. È inoltre importante ricordare che questo metodo monitora l'equilibrio tra l'attività chinasica e quella fosfatasica all'interno di una cellula. Questa procedura può essere combinata con schermate di interferenza dell'RNA o di inibitori per identificare i regolatori a monte di queste chinasi e fosfatasi.