Selezione e isolamento di colonie di cellule pluripotenti indotte umane staminali riprogrammato da fibroblasti adulti

In questo articolo video, i fibroblasti umani adulti vengono riprogrammati per generare cellule staminali pluripotenti mediante vettori retrovirali. In primo luogo, i fibroblasti umani vengono trasdotti con vettori retrovirali che codificano per i fattori di trascrizione T three four, SOX two, KLF four e cmic.

I fibroblasti infetti vengono coltivati su cellule di sostegno embrionali di topo per un periodo di 14-28 giorni. Le colture ottenute vengono colorate con l'anticorpo TRA 180 1 per identificare le colonie di cellule riprogrammate. Le colonie positive vengono quindi trasferite in piastre contenenti MEF per l'espansione.

La colorazione immunoistochimica conferma l'espressione dei marcatori di pluripotenza e la creazione di linee cellulari staminali pluripotenti. Successivamente, dovrebbero essere effettuati ulteriori studi per caratterizzare meglio le linee. In generale, le persone alle prime armi con la riprogrammazione delle cellule somatiche e con le colture di cellule staminali pluripotenti indotte umane incontreranno difficoltà, poiché è complesso identificare le colonie di IPSC corrette.

La procedura sarà dimostrata dalla dottoressa Sula Pollak, ricercatrice post-dottorato del mio laboratorio. Iniziare la procedura seminando le cellule Phoenix AM FO a una densità di circa sette-otto milioni di cellule per piastra da 10 centimetri in 10 millilitri di DMEM ad alto contenuto di glucosio, coltivandole in incubatore per tutta la notte. Il giorno successivo, preparare le miscele di trasfezione contenenti 12 microgrammi di un vettore che codifica per T three four SOX, due klf, quattro cmic o il gene GFP e 35 microlitri di few gene six, in un volume totale di 500 microlitri di DMEM ad alto contenuto di glucosio privo di siero e contenente L-glutamina.

Incubare le miscele per 20 minuti. Successivamente, per trasfettare le cellule phoenix, pipettare delicatamente i complessi di DNA nelle piastre contenenti le cellule phoenix, che dovrebbero essere confluenti al 70-80%. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi dopo sei-otto ore.

Aspirare il mezzo e sostituirlo con otto millilitri di DMEM ad alto contenuto di glucosio con antibiotici. Quindi reinserire le piastre nell'incubatore per 12 ore dopo l'incubazione. Utilizzare una pipetta per aspirare e raccogliere il mezzo contenente il virus.

Quindi sostituire il mezzo e ripetere questo processo ogni 12 ore fino a quando il mezzo è stato raccolto quattro volte. Conservare il mezzo a quattro gradi centigradi. Una volta raccolto tutto il mezzo, unire tutte le porzioni, quindi versarlo attraverso un filtro a membrana da 0,45 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri per rimuovere le cellule staccate e i detriti.

Il mezzo filtrato, che contiene le particelle virali, può essere conservato in frigorifero per due settimane senza perdere attività infettiva. Il congelamento non è consigliato. Il giorno precedente la procedura di trasduzione, scongelare la riserva congelata di fibroblasti umani adulti e aggiungere una volta 10 alla quinta cellule per ogni pozzetto di piastre da sei pozzetti rivestite con gelatina.

Il giorno successivo, in un tubo conico da 50 millilitri, combinare 3,5 millilitri ciascuno di T four SOX two, klf four e mezzo virale cmic, e aggiungere poly brain a una concentrazione finale di sei microgrammi per litro come controllo. Preparare un millilitro di mezzo virale GFP, tre millilitri di mezzo di coltura e poly brain a una concentrazione finale di sei microgrammi per millilitro. Aspirare il mezzo dalla piastra contenente fibroblasti umani.

Quindi aggiungere quattro millilitri di mezzo virale misto o mezzo di controllo, centrifugare le piastre a 1600 ×g per un'ora a 20 °C. Dopo la centrifugazione, incubare le piastre per circa 12 ore. Quindi sostituire il mezzo virale con mezzo di coltura per fibroblasti e incubare per altre 12 ore.

Ripetere questo processo dall'infezione alla coltura nel mezzo per fibroblasti, altre due volte dopo l'ultima infezione. Coltivare i fibroblasti in DMEM per 48 ore. Quindi verificare l'efficienza dell'infezione delle trasduzioni parallele con il mezzo retrovirale GFP.

Successivamente, avviare il riprogrammazione da cellule somatiche a cellule pluripotenti. I fibroblasti infettati vengono coltivati in mezzo per cellule staminali embrionali umane o mezzo HES, seminando fibroblasti embrionali di topo, o MEF, a una densità di circa due per 10 alla quinta cellule per pozzetto di una piastra a sei pozzetti trattata con gelatina, nel mezzo di crescita per fibroblasti il giorno successivo.

Dividere i fibroblasti umani infetti utilizzando tripsina-EDTA 0,05% e seminare a una densità di circa 1,2 × 10⁴ per pozzetto nel mezzo di crescita per fibroblasti. Il giorno successivo, sostituire il mezzo con mezzo HES contenente butirrato di sodio 0,5 millimolare per i primi sette giorni del riprogrammamento.

Cambiare il mezzo ogni giorno. Sostituire i mezzi con mezzo HES senza butirrato di sodio e continuare la riprogrammazione per ulteriori sette a 21 giorni. Cambiare il mezzo ogni giorno.

Verificare le cellule transdotte per eventuali cambiamenti morfologici. Dopo circa 10 giorni dal trasferimento dei fibroblasti transdotti su cellule feeder, inizieranno a comparire delle colonie cellulari. Le colonie contenenti le cellule riprogrammate sono ora definite cellule staminali pluripotenti indotte umane o cellule iPS umane.

Le colonie di cellule iPS umane saranno pronte per essere isolate da 14 a 28 giorni dopo essere state seminate su cellule di supporto MEF. A questo stadio, le colonie di cellule iPS umane possono essere trasferite su piastre contenenti MEF o rivestite con matrigel. Il trasferimento su piastre contenenti MEF viene dimostrato un giorno prima del prelievo delle colonie di cellule iPS umane. Seminare piastre a 24 pozzetti contenenti cellule di supporto MEF irradiate con raggi gamma in mezzo di crescita per fibroblasti.

Incubare a 37 gradi Celsius con 5% CO2 nel giorno in cui verranno selezionate le colonie di cellule iPS umane. Aspirare il mezzo di crescita per i fibroblasti dai ME Fs e risciacquarli con PBS per rimuovere eventuali tracce di siero fetale bovino. Successivamente, aggiungere 0,5 millilitri di mezzo per cellule staminali embrionali umane o mezzo HES contenente 10 micromolar di inibitore ROCK Y 2 7 6 3 2 in ogni pozzetto; quindi, utilizzando un microscopio posizionato all'interno di una cappa a flusso laminare, esaminare le piastre di riprogrammazione per la formazione delle colonie di cellule iPS umane.

Se necessario, rimuovere i fibroblasti che circondano le colonie di cellule staminali pluripotenti indotte umane con un ago da 21 gauge. Lavare le piastre con PBS e aggiungere del mezzo HES fresco contenente l'anticorpo specifico per cellule vive TRA 180 1. Reintrodurre le cellule nell'incubatrice a 37 gradi centigradi con 5% CO2.

Dopo 30 minuti, sostituire il mezzo con mezzo HES fresco integrato con inibitore della ROCK a 10 micromolar. Quindi osservare le colonie al microscopio a fluorescenza. Contrassegnare le colonie positive per TRA uno a 81.

Utilizzando un marcatore oggettivo con un ago da 21 gauge, tagliare le colonie di cellule iPS umane positive per TRA 180 1 in diversi pezzi piccoli. Successivamente, trasferire con una pipetta automatica i frammenti di colonie di cellule iPS umane in singole pozzette di una piastra a 24 pozzette contenente MEFs. Evitare di trasferire cellule non iPS.

Posizionare le piastre nell'incubatrice e lasciare che le colonie di cellule iPS umane si attacchino per 24-36 ore, cambiando il mezzo ogni giorno. Le colonie di cellule iPS umane con morfologia corretta simile a quella di cellule HE saranno visibili 48 ore dopo il trasferimento iniziale su una piastra a 24 pozzetti; passaggi manuali delle colonie di cellule iPS umane ogni sei-otto giorni tagliandole con un ago da 21 gauge. Espandere le colture su una piastra a 12 pozzetti e successivamente su una piastra a 6 pozzetti dopo l'espansione clonale.

E dopo aver stabilito le linee cellulari di IPS umane, analizzare l'espressione dei marcatori di pluripotenza TRA-1-60, SSEA-4, T3, SOX2 e Nanog mediante immunoistochimica una volta che le linee sono state stabilite. Una caratterizzazione dettagliata può comprendere analisi di differenziazione in vitro e in vivo, analisi del cariotipo, analisi del silenziamento dei transgeni, studi di metilazione e studi sull'espressione genica.

Una trasduzione efficiente con mezzo contenente retrovirus è fondamentale per un riprogrammazione di successo al fine di determinare l'efficacia della trasduzione virale. I fibroblasti umani adulti derivati da un paziente affetto da atassia di Friedreich sono stati visualizzati dopo due infezioni consecutive con mezzo retrovirale GFP; quando i fibroblasti sono stati infettati mediante semplice incubazione con il mezzo virale, meno del 20% delle cellule è stato trasdotto. Tuttavia, quando l'aggiunta del mezzo retrovirale GFP è stata immediatamente seguita da centrifugazione, l'efficienza di trasduzione è aumentata in modo drammatico.

Qui oltre l'80% delle cellule viene trasdotta per effettuare una caratterizzazione iniziale delle colonie di cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) umane isolate. L'espressione dei marcatori di pluripotenza caratteristici delle cellule staminali embrionali umane è stata valutata mediante immunoistochimica, come mostrato qui. Le colonie isolate di cellule iPS umane sono risultate positive per i marcatori di pluripotenza.

T tre quattro SOX due nano SSEA quattro e TRA uno 60 DNA. La colorazione con Cos e DPI mostrata nei pannelli superiori è rilevata sia nelle colonie di cellule iPS umane che nelle cellule di supporto. Questi risultati dimostrano che le cellule iPS umane ottenute mediante questo protocollo di riprogrammazione esprimono marcatori di pluripotenza appropriati, caratteristici delle cellule staminali pluripotenti umane indifferenziate.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come riprogrammare con successo i fibroblasti umani in cellule staminali pluripotenti utilizzando la transduzione retrovirale, identificare correttamente le colonie di cellule staminali pluripotenti umane e condurre la caratterizzazione iniziale delle iPS.