Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

Ciao, sono Jersey. Ciao, mi chiamo Shabi e siamo entrambi ricercatori postdottorandi all'Imperial College di Londra, dove lavoriamo con il Professor Andrew Di Melo e il Dottor Josh Del su piattaforme microfluidiche a goccioline. Le piattaforme microfluidiche basate su goccioline sono candidati promettenti per sperimentazioni ad alto rendimento, poiché possono essere generate con volumi molto precisi e ben definiti e, per quanto riguarda la loro produzione, la frequenza di generazione può raggiungere diversi kilohertz.

Inoltre, poiché la regione di interesse può essere incapsulata in compartimenti anche di pochi litri, sia il crosstalk che la dispersione possono essere eliminati, e i processi analitici possono essere temporizzati con maggiore precisione. Nel nostro gruppo, abbiamo già implementato con successo piattaforme a goccioline microfluidiche per numerose applicazioni. Ad esempio, reazione a catena della polimerasi, sintesi di nanoparticelle e saggio cellulare a livello di singola molecola.

Le grandi quantità di informazioni generate all'interno di questi sistemi devono essere estratte, sfruttate e utilizzate in modo efficiente. A questo riguardo, il metodo di rilevamento prescelto dovrebbe essere appropriato, fornire un'elevata sensibilità e bassi limiti di rilevamento, essere applicabile a un'ampia gamma di specie molecolari, essere non distruttivo e poter essere integrato facilmente con dispositivi microfluidici. Per soddisfare questa esigenza, abbiamo sviluppato un insieme di strumenti sperimentali e protocolli che consentono l'estrazione di grandi quantità di informazioni fisiche da ambienti a piccolo volume, ed è applicabile all'analisi di un'ampia gamma di parametri fisici, chimici e biologici.

In questo protocollo, presenteremo due metodi applicati al rilevamento di singole cellule e alla mappatura dei processi di miscelazione in Dropbox. I chip microfluidici sono tradizionalmente realizzati in poli dimetil silossano PGMS mediante tecniche di fotolitografia. Questo processo deve essere eseguito in una struttura di sala bianca per ottenere canali microfluidici Spinco, SU 8 50 su un wafer di silicio; cottura soft su una piastra riscaldante a 65 gradi e 95 gradi per evaporare il solvente e densificare il film; dopo il raffreddamento, esporre la resist SU 8 alla radiazione UV sotto la maschera appropriata, quindi cuocere nuovamente il wafer a 65 gradi e 95 gradi dopo il raffreddamento.

Sviluppare le aree non esposte utilizzando la soluzione sviluppatrice appropriata sotto agitazione. Risciacquare la wafer con solvente EC fresco e quindi asciugarla sotto flusso di gas per ottenere una superficie pulita. Trattare la wafer con lavaggi a base di esano e metanolo.

Inoltre, per completare il processo di fabbricazione del master, evaporare un agente di adesione sulla superficie in un essiccatore per 40 minuti. Per formare substrati microfluidici strutturati, mescoliamo S guard 1 8 4 in un rapporto di 10 a 1 tra resina e crosslinker, quindi stendiamo questa miscela sul master. Degasare il tutto in un essiccatore e polimerizzare il dispositivo a 65 gradi.

Tagliare il PDMS polimerizzato e staccarlo dal master. Creare fori di accesso per i tubi fluidici utilizzando un punch per biopsia. Polimerizzare un altro strato di PDMS per 20 minuti a 65 gradi.

Posizionare lo strato superiore preparato sullo strato inferiore e polimerizzare tutta la notte a 65 gradi. Staccare le chip dalla piastra di Petri e tagliarle a cubetti. Una volta fabbricate, le chip sono pronte per essere utilizzate, infondendo le soluzioni di interesse.

Riempire le siringhe con le soluzioni richieste, assicurandosi che non rimangano bolle d'aria in nessuna parte dei tubi. Per la generazione di goccioline, si utilizzano due fasi. La fase dispersa acquosa contiene i reagenti di interesse.

La fase oleosa agisce come fase continua; collegare tubi con lo stesso diametro interno delle punte degli aghi delle siringhe a un'estremità degli aghi, montare le siringhe su una pompa per siringhe e impostare la velocità di flusso desiderata per l'infusione. Per ciascuna fase, si raccomanda un rapporto minimo tra le velocità di flusso oleoso e acquoso pari a uno, per evitare il bagnamento del PDMS da parte della fase acquosa, il che porterebbe a una formazione instabile delle goccioline. Collegare le altre estremità dei tubi direttamente ai fori praticati nel substrato in PDMS.

Per soluzioni più complesse, possono essere utilizzate anche silice, porte capillari o connettori. Collegare la porta di uscita del chip al tubo e indirizzare verso un collettore per la raccolta dei rifiuti o per ulteriori analisi. Una volta completata questa configurazione, esistono due principali configurazioni di microcanali per generare goccioline: il flusso focalizzato o il formato a giunzione a T, risultanti dalle forze di taglio che si sviluppano utilizzando queste geometrie per unire i due fluidi ammissibili e dai successivi effetti capillari che si instaurano all'interfaccia.

Si generano spontaneamente goccioline di un oh con volumi ridotti a pochi femtolitri. Una volta che le goccioline vengono generate, possono essere analizzate mediante un apparato ottico. Il sistema ottico è configurato secondo il seguente protocollo.

Utilizzare un microscopio confocale dotato di capacità di posizionamento automatizzato submicrometrico e di un laser che opera a una lunghezza d'onda corrispondente all'assorbimento dei fluorocromi coinvolti. Per eccitarli, utilizzare un laser a impulsi che opera a frequenze di ripetizione di diversi megahertz per l'immagine del tempo di vita della fluorescenza. Gli esperimenti con flemma utilizzano specchi deviatori del fascio e ottiche per controllare l'altezza e la direzione del fascio.

Utilizzare uno specchio dicromatico per riflettere il fascio laser nell'obiettivo. Se si utilizzano due laser contemporaneamente, è possibile installare uno specchio dicromatico a doppia banda. Per consentire la riflessione dei due fasci laser, utilizzare un obiettivo microscopico con apertura numerica NA elevata e correzione all'infinito, in modo da focalizzare strettamente la luce laser all'interno di un canale microfluidico.

Raccogliere la fluorescenza emessa dal campione all'interno del canale microfluidico, utilizzando lo stesso obiettivo ad alta apertura numerica e facendola passare attraverso lo stesso specchio dicromatico. Rimuovere qualsiasi luce residua di eccitazione mediante un filtro di emissione a banda singola o doppia. Focalizzare l'emissione di fluorescenza su un foro stenopeico di 75 micrometri.

Utilizzando una lente piano-convessa. Posizionare il pinhole nel piano confocale dell'obiettivo del microscopio. Utilizzare un altro specchio dicromatico per dividere il segnale fluorescente su due rivelatori.

Filtrare la fluorescenza riflessa dallo specchio dicromatico mediante un filtro di emissione e focalizzarla con una lente piano-convessa sul primo rivelatore. Per esperimenti che coinvolgono un fluorocromo rosso secondario, filtrare la fluorescenza trasmessa dallo specchio dicromatico con un altro filtro di emissione, quindi focalizzarla con un'altra lente piano-convessa sul secondo rivelatore. Utilizzare fotodiodi a valanga per la rilevazione dei fotoni di fluorescenza.

Per l'acquisizione dei dati di fluorescenza, collegare il segnale elettronico proveniente dal rivelatore a fotodiodo a valanga a un dispositivo DAQ multifunzione per la registrazione dei dati, in esecuzione su un computer personale. Per gli esperimenti con flegma, utilizzare un laser a impulsi e collegare i rivelatori a una scheda TCS PC per il conteggio dei singoli fotoni in correlazione temporale, in esecuzione su un PC separato. Questa scheda consente di ottenere i dati relativi al tempo di vita della fluorescenza.

Utilizzando una metodologia TCS PC. Ogni fotone fluorescente rilevato viene correlato a un impulso laser incidente e quindi a ogni fotone fluorescente emesso viene assegnato un tempo di ritardo. Questi dati possono essere adattati a una curva di decadimento esponenziale singola o multipla per ottenere una stima della velocità radiativa dei fluorocromi.

Ora sappiamo che le cellule sono altamente eterogenee da un punto di vista biologico, fisico e chimico. Pertanto, idealmente, dovremmo analizzare ogni cellula singolarmente. Tuttavia, i saggi devono essere eseguiti con un'elevata produttività in modo da raccogliere informazioni quantitative sufficienti per giungere a conclusioni affidabili e significative.

Qui abbiamo un esempio di incapsulamento di cellule di e coli in una singola goccia, in modo che possa essere eseguito. Utilizzare il ceppo e coli top 10 coltivato durante la notte. Per rilevare la vitalità delle cellule, usare citina nove e ioduro di propidio.

Entrambi i coloranti sono coloranti intercalanti del DNA e la loro intensità di fluorescenza aumenta di oltre 20 volte. Una volta legati al DNA, la citocina è un colorante fluorescente verde permeabile alla membrana e l'ioduro di propidio è un colorante fluorescente rosso impermeabile alla membrana.

Pertanto, le cellule vive fluorescono in verde, mentre le cellule morte mostrano emissioni sia verdi che rosse. Qui possiamo osservare la generazione di goccioline e l'incapsulamento di una singola cellula mediante un giunto a T. Questo video è stato registrato con una telecamera ad alta velocità, ma le goccioline possono essere generate a una velocità di migliaia al secondo.

Quando si incapsulano cellule, è necessario assicurarsi che la coltura cellulare sia diluita in modo che il numero di cellule sia inferiore al numero di goccioline generate e che le cellule siano impedite a sedimentare, fenomeno che può verificarsi nella siringa o nei tubi. Utilizzare una barretta magnetica all'interno della siringa per mantenere le cellule uniformemente distribuite nella soluzione. Usare tubi molto sottili, di 50 micrometri, per collegare la siringa al microchip.

Questo garantisce una velocità di flusso elevata all'interno del tubo e quindi impedisce alle cellule di sedimentare. Di seguito sono riportati esempi tipici di conteggi di fotoni in funzione del tempo per esperimenti basati su cellule. Per mappare i processi di mescolamento all'interno delle goccioline.

Le goccioline possono essere generate utilizzando due diversi fluoro fours con tempi di vita differenti. All'interno di una gocciolina in movimento, si genera un campo di flusso, che alla fine mescola le due soluzioni inizialmente separate per potenziare il processo di miscelazione. La simmetria del campo di flusso può essere modificata utilizzando canali serpentinati.

Per analizzare le goccioline, focalizzare il volume della sonda ottica a metà dell'altezza di un microcanale lungo il quale scorrono le goccioline, partendo da un lato del canale ed eseguendo ogni esperimento lungo tutta la larghezza del canale, a intervalli di un micrometro. Implementare un algoritmo per differenziare i singoli picchi associati alle goccioline dal rumore di fondo della fase oleosa e per determinare la durata di ciascun picco.

Implementare un secondo algoritmo per estrarre i valori di tempo di ritardo e intensità lungo la lunghezza di ciascuna goccia alla larghezza specifica in cui è stato condotto l'esperimento. Successivamente, utilizzare un algoritmo di stima della massima verosimiglianza (MLE) per valutare il tempo di vita fluorescente di ogni goccia nell'esperimento. Mediando i valori di tempo di vita di tutte le gocce presenti nell'esperimento, si riduce l'errore finale del calcolo MLE.

Più gocce vengono analizzate, minore sarà l'errore una volta ottenuta una traiettoria di vita. Per ogni larghezza, combinare tutte le traiettorie in una mappa 2D. Poiché a ogni valore di vita è associata una particolare miscela delle due flora fours, può essere così ottenuta una mappa di concentrazione o di miscelazione.

È stata descritta la fabbricazione di un microdispositivo e dell'apparato sperimentale, nonché i protocolli associati per la formazione di microgocce, l'incapsulamento in regioni specifiche e il rilevamento ottico del processo e delle gocce stesse. I due esempi selezionati, il rilevamento di singole cellule all'interno delle gocce e la mappatura dei processi di miscelazione, rappresentano applicazioni comuni attualmente oggetto di studio nella microfluidica a gocce.

Come illustrano gli esperimenti presentati, le piattaforme a microfluidica a goccioline presentano alcune caratteristiche interessanti, come l'elevata produttività, il perfetto confinamento e una riproducibilità superiore. La grande quantità di informazioni prodotta e la velocità elevata con cui queste informazioni vengono generate richiedono l'uso di metodi di rilevamento rapidi con la massima risoluzione spaziotemporale, al fine di sfruttare appieno i vantaggi offerti da queste piattaforme miniaturizzate.

In questo caso, dimostriamo che ciò è possibile utilizzando tecniche spettroscopiche fluoro altamente precise.