Murine superficiale Lymph Chirurgia Node
21 maggio 2012
Per seguire la progressione di una risposta immunitaria nel tempo all'interno del mouse stesso, linfonodi può essere sequenzialmente asportato chirurgicamente. Qui, si descrive come questa tecnica può essere eseguita.
L'obiettivo generale di questa procedura è rimuovere chirurgicamente i linfonodi da un topo anestetizzato. Questo viene ottenuto innanzitutto localizzando i linfonodi. I linfonodi vengono quindi prelevati e successivamente l'incisione viene chiusa.
Infine, può essere ottenuta una sospensione di singole cellule per l'analisi sperimentale. In ultima analisi, le popolazioni di linfociti vitali possono essere valutate mediante citometria a flusso. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale, poiché la localizzazione e l'asportazione dei linfonodi devono essere osservate per essere apprese correttamente.
Dopo aver anestetizzato il topo, applicare un unguento oculare, iniettare buprenorfina e confermare la sedazione mediante il test della pressione sulle dita dei piedi, quindi posizionare il topo sul fianco. Localizzare innanzitutto il linfonodo brachiale e quindi rasare la regione da dissezionare. Dopo aver rimosso eventuali peli sciolti, applicare un disinfettante sulla zona e praticare una piccola incisione di circa cinque millimetri sul dorso del quarto arto.
Utilizzare due paia di pinze per allargare l'incisione fino a quando non si riesce a vedere il linfonodo brachiale, che può apparire grigiastro o più scuro rispetto al grasso circostante. Poi afferrare con un paio di pinze la fascia che ricopre il linfonodo. Posizionare il secondo paio di pinze il più possibile al di sotto del linfonodo e tirare leggermente sulla membrana senza rompere i tessuti circostanti.
Quindi utilizzare la prima coppia di pinzette per rompere la fascia ed estrarre il linfonodo. Se il linfonodo è stato correttamente prelevato, apparirà una macchia di sangue nel punto in cui si trovava in precedenza. Posizionare il linfonodo escisso in una soluzione isotonica; se affonda, ciò confermerà che il tessuto prelevato è un linfonodo e non tessuto adiposo.
Successivamente, verificare che non ci siano peli nella ferita e chiudere l'incisione unendo insieme i due lembi interni della pelle e applicando uno o due punti metallici, a seconda delle dimensioni dell'incisione. Ora localizzare un linfonodo inguinale e rasare la regione da dissezionare. Dopo aver rimosso eventuali peli sciolti, applicare un disinfettante sulla zona e quindi praticare un piccolo incisione di circa cinque millimetri sopra la zampa posteriore in prossimità dell'addome.
Dopo aver aperto l'incisione con due paia di pinze come appena mostrato per il linfonodo brachiale, identificare il linfonodo inguinale situato nel tessuto adiposo circostante. Quindi rimuovere il linfonodo utilizzando i due paia di pinze come precedentemente dimostrato. Confermare nuovamente il prelievo riuscito del linfonodo osservando la macchia di sangue che appare nel punto in cui il linfonodo era precedentemente localizzato, quindi depositare il linfonodo inguinale in un contenitore separato di soluzione isotonica.
Dopo aver prelevato tutti i linfonodi, posizionare il topo in una gabbia e aggiungere cibo umido in modo che possa nutrirsi facilmente. Dopo l'intervento chirurgico, circa sei-otto ore più tardi, verificare che il topo non stia provando dolore. Osservare attentamente che postura, andatura, interazione con i congeniti e aspetto del pelo siano simili a quelli di un topo sano normale.
Infine, dissociare il linfonodo premendolo contro vetrini smerigliati in una piastra di Petri e quindi trasferirlo in un tubo per ottenere una sospensione di singole cellule. Dopo aver colorato le cellule per gli antigeni di superficie di interesse, analizzare le cellule mediante citometria a flusso. Qui vengono mostrati esempi di scatterplot di diffusione anteriore e laterale per linfonodi prelevati da animali anestetizzati o sacrificati.
I profili e le percentuali delle cellule all'interno dei gate dei linfociti vitali nei due grafici a dispersione sono identici. Questo dimostra che l'intervento chirurgico sui linfonodi è una tecnica appropriata per il prelievo di cellule. Una volta acquisita padronanza, l'intervento chirurgico sui linfonodi può essere eseguito in cinque-dieci minuti per topo, se effettuato correttamente.
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Panoramica
In questo articolo viene descritta una tecnica chirurgica per rimuovere in modo sequenziale i linfonodi da un topo anestetizzato al fine di monitorare la risposta immunitaria nel tempo. La procedura comprende la localizzazione dei linfonodi, il loro prelievo e la chiusura dell'incisione, seguita dall'ottenimento di una sospensione di singole cellule per l'analisi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Tecniche Chirurgiche
- Analisi Sperimentale
Sfondo
- Comprendere le risposte immunitarie è fondamentale nella ricerca.
- I linfonodi svolgono un ruolo chiave nel sistema immunitario.
- La rimozione sequenziale consente un'analisi temporale delle risposte immunitarie.
- Le tecniche visive migliorano l'apprendimento e la padronanza della procedura.
Scopo dello studio
- Dimostrare l'asportazione chirurgica dei linfonodi nei topi.
- Facilitare lo studio dell'evoluzione della risposta immunitaria.
- Fornire una guida visiva ai ricercatori.
Metodi Utilizzati
- Localizzazione dei linfonodi in un topo anestetizzato.
- Rimozione chirurgica dei linfonodi.
- Chiusura dell'incisione dopo l'intervento chirurgico.
- Preparazione di una sospensione di singole cellule per l'analisi.
Risultati principali
- È stata raggiunta una rimozione efficace dei linfonodi.
- Sono state ottenute popolazioni vitali di linfociti.
- La citometria a flusso è stata utilizzata per la valutazione dei linfociti.
- Le dimostrazioni visive hanno migliorato la comprensione della tecnica.
Conclusioni
- La tecnica consente un efficace monitoraggio delle risposte immunitarie.
- Gli ausili visivi sono essenziali per padroneggiare le procedure chirurgiche.
- Studi futuri possono basarsi su questo metodo per ottenere approfondimenti più dettagliati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La chirurgia sequenziale dei linfonodi consente un monitoraggio longitudinale delle risposte immunitarie all'interno dello stesso animale, riducendo la variabilità sperimentale e supportando la riduzione del rischio meccanicistico nella validazione degli obiettivi. Questo approccio fornisce un numero sufficiente di linfociti vitali per saggi fenotipici e funzionali, aumentando la fiducia predittiva negli studi preclinici di immunologia. Facilitando esperimenti su un arco temporale, la tecnica supporta la continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante l'analisi temporale dell'espansione dei linfociti nei linfonodi.
- Valore operativo: Riduce l'utilizzo di animali e la variabilità sperimentale eseguendo campionamenti ripetuti nello stesso topo.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico caratterizzando nel tempo i fenotipi dei linfociti residenti nei linfonodi.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce da 1 a 2x10⁶ cellule per linfonodo, quantità sufficiente per la caratterizzazione fenotipica e per saggi funzionali.
- Valore operativo: Fornisce sospensioni cellulari standardizzate e riproducibili per analisi mediante citometria a flusso successiva.
- Valore scientifico: Permette la preparazione di sistemi biologici validati per la valutazione affidabile di composti nell'ambito dello screening immunologico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione di sistemi pertinenti alle malattie monitorando nel tempo la dinamica delle cellule immunitarie nei linfonodi.
- Valore operativo: Favorisce l'allineamento traslazionale dei biomarcatori attraverso il monitoraggio longitudinale dell'immunità.
- Valore scientifico: Migliora la fiducia predittiva nei modelli preclinici consentendo la riduzione del rischio meccanicistica delle vie immunitarie.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla verifica delle ipotesi fino alla validazione preclinica, supportando il monitoraggio della risposta immunitaria e l'analisi funzionale dei linfociti.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'analisi temporale della risposta immunitaria.
- Screening: Permette la preparazione del saggio attraverso sospensioni monocellulari riproducibili ottenute da linfonodi isolati.
- Analisi: Genera popolazioni quantitative di linfociti per il confronto basato sulla citometria a flusso in diversi punti temporali.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica mediante un monitoraggio immunitario continuo in sistemi rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una capacità chirurgica riutilizzabile per studi immunologici longitudinali in più progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi attraverso il monitoraggio longitudinale della risposta immunitaria.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità nella raccolta e lavorazione dei linfociti.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei programmi di immunologia.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio basata sui dati temporali della risposta immunitaria ottenuti da campionamenti sequenziali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche chirurgiche su modelli murini e nei protocolli di anestesia.
- Necessita di strumentazione sterile e soluzioni isotoniche per la conservazione del tessuto.
- Richiede una standardizzazione tra i gruppi per una localizzazione e un prelievo costanti dei linfonodi.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi siti linfonodali (brachiale, inguinale) e ceppi murini.
- È limitato dagli intervalli di recupero postoperatorio, che consentono il campionamento ogni due giorni per ciascun linfonodo.
