Di campo elettrico controllato migrazione diretta di cellule progenitrici neurali in ambienti 2D e 3D

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare l'effetto dei campi elettrici applicati sulla migrazione delle cellule progenitrici neurali in colture 2D e modelli 3D ex vivo. Questo viene raggiunto isolando ed espandendo in vitro le cellule progenitrici neurali. Il secondo passaggio consiste nel preparare una sospensione monocellulare di cellule progenitrici neurali.

Successivamente, per la preparazione della coltura 2D, le cellule progenitrici neurali vengono seminate in camere elettrotattiche appositamente progettate. In alternativa, per la preparazione del modello 3D ex vivo, le cellule progenitrici neurali vengono marcate con gli uncini 3, 3, 3, 4, 2 e iniettate in un modello organotipico di fetta di midollo spinale. Infine, viene applicato un campo elettrico alle camere elettrotattiche e viene effettuata una registrazione in time-lapse per dimostrare che le cellule progenitrici migrano verso il catodo del campo elettrico sia negli ambienti 2D che 3D.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce un metodo innovativo per il tracciamento in tempo reale della migrazione indotta da campo elettrico di singole cellule dopo il trapianto in un modello organotipico 3D, che rispecchia da vicino l'ambiente naturale. Questo metodo può non solo fornire informazioni dettagliate sulla tecnica elettrofisiologica e sulla migrazione di cellule neurali trapiantate in sezioni di midollo spinale, ma può anche essere applicato ad altri sistemi, come modelli di sezioni cerebrali più piccole. Per iniziare questa procedura, preparare strisce di vetro di 22 per 11 millimetri dividendo in due il vetro autoclavato di 22 per 22 millimetri.

Dividere a metà vetrini di spessore numero uno utilizzando una penna a punta di diamante. Successivamente, creare una camera di vetro autoportante con dimensioni interne di 22 per 10 millimetri incollando insieme quattro strisce di vetro verticali, di dimensioni 22 per 11 millimetri, con grasso siliconico ad alto vuoto; lasciare asciugare e indurire completamente la camera durante la notte. Il giorno seguente, fissare due strisce di vetro da 22 per 11 millimetri parallelamente tra loro, lasciando un'apertura di 10 millimetri, alla base di una piastra di coltura da 100 millimetri utilizzando grasso siliconico.

Quindi sigillare la regione tra queste strisce applicando un coprioggetto di 22 per 22 millimetri con grasso al silicone. Posizionare il pozzetto di vetro sui coprioggetti in modo che le pareti interne creino uno spazio confinato per la semina delle cellule. Impermeabilizzare tutti i giunti con grasso al silicone.

Rivestire questa regione confinata in modo sequenziale con poli-l-lisina, seguito da laminina, come descritto nel manoscritto allegato. In questo procedimento, ottenere i cervelli di topi da E14 a E16 e posizionarli in mezzo basale D-M-E-M-F12 freddo. Successivamente, rimuovere le meningi sotto un microscopio anatomico.

In seguito, trasferire i cervelli in una piastra di Petri da 35 millimetri. Utilizzare la pinzetta fine per dissociare i cervelli in frammenti di tessuto. Successivamente, trasferirli in una provetta centrifuga da 15 millilitri.

Centrifugare i campioni a 800 giri al minuto per tre minuti per rimuovere i detriti. Successivamente, aggiungere A-D-M-E-M-F 12 contenente BFDF e DGF ai campioni. Emulsionare i campioni con una pipetta da un millilitro.

Quindi ottenere la sospensione monocellulare utilizzando un filtro per cellule. Piastrare le cellule nei flaconi a una concentrazione di 20.000-50.000 cellule per millilitro. Eseguire quindi un completo cambio di mezzo ogni tre giorni, che prevede la centrifugazione delle cellule a 1.300 giri al minuto per cinque minuti.

Scartare il soprannatante del Resus, sospendere il PT in mezzo fresco e reinserire le cellule nel flacone ogni sei giorni dopo almeno cinque passaggi. Trasferire le NEUROSFERE in una provetta da centrifuga da 15 millilitri a 1.500 giri al minuto per cinque minuti. Scartare il soprannatante.

Risospendere il pellet in triplice risciacquo in EDTA per ottenere una sospensione di singole cellule. Prima di eseguire il conteggio cellulare, preparare un millilitro di sospensione contenente 10.000 cellule. Successivamente, rimuovere la laminina dalla pozzetta di vetro e lasciarla asciugare completamente.

Sostituirlo con un millilitro di sospensione cellulare. Successivamente, posizionare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per un minimo di quattro ore per consentire l'adesione. Una volta che le cellule sono sufficientemente confluenti, rimuovere il mezzo dal compartimento.

Rimuovere con attenzione il vetro. Formare quindi una copertura sulle cellule attaccando accuratamente una lamella di vetro autoclavata di 22 per 22 millimetri tra due strisce di 22 per 11 millimetri utilizzando grasso al silicone. Ricordare di coprire le cellule con alcune gocce di mezzo per evitare che si secchino.

Formare quindi una riserva isolata di mezzo a ciascuna estremità della camera creando due barriere impermeabili di grasso al silicone che si estendono da un'estremità della piastra all'altra. Riempire la camera con mezzo fresco, assicurando un flusso da una riserva di mezzo all'altra. Successivamente, reinserire la piastra nell'incubatrice per 12 ore per consentire il recupero cellulare.

Nel passaggio successivo, preparare un coperchio per coprire la piastra praticando due fori, uno posizionato sopra ciascun serbatoio della camera di migrazione. Successivamente, sostituire il mezzo nella camera con del mezzo colturale contenente 25 millimolar hippies buffer. Dopodiché, trasferire la piastra nel sistema di imaging a temperatura controllata.

Impostare i parametri sperimentali per la registrazione con lapse temporale e a più posizioni. Allineare la camera in modo che il catodo e l'anodo siano rispettivamente a sinistra e a destra, in modo da garantire che il vettore del campo elettrico si estenda orizzontalmente quando osservato al microscopio e registrato nel sistema di acquisizione immagini. Successivamente, riempire due becher.

Con la soluzione di Steinberg. Collegare un becher separato a ciascun serbatoio del mezzo utilizzando i ponti di vetro pre-preparati riempiti con soluzione di agar al 2% di Steinberg. Successivamente, posizionare gli elettrodi d'argento collegati a un alimentatore in corrente continua nella soluzione di Steinberg.

In ciascun becher, impostare il selettore della tensione dell'alimentatore su zero e accenderlo. Misurare la tensione ai capi della camera elettotattica con un voltmetro mentre si aumenta il selettore della tensione. Quindi regolare la tensione in base alle esigenze sperimentali.

Dopo di ciò, avviare la registrazione in time-lapse. Eseguire un cambio di mezzo e riaggiustare la tensione secondo necessità. Ogni ora, farmaci o agenti chimici freschi possono essere aggiunti ai serbatoi secondo necessità.

Utilizzando fori aggiuntivi praticati nel coperchio della piastra di coltura, posizionandone uno sopra ciascun serbatoio di mezzo. In questo passaggio, dissezionare i midolli spinali lombari di topi di due settimane di età. Successivamente, tagliare i midolli spinali in sezioni spesse 500 micron mediante un tagliatore di tessuti MacIlwain sotto un microscopio anatomico.

Separare le sezioni e selezionare quelle con struttura midollare assiale sagittale intatta. Successivamente, posizionare le sezioni in una piastra di Petri da 100 millimetri contenente 30 microlitri di gel MA. Disporle il più vicino possibile al centro.

Coltivarli in un incubatore con 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Affinché le proteine della matrice gel si autoassemblino e producano un sottile film che ricopre la superficie delle sezioni di midollo spinale, è molto importante che l'assemblaggio della matrice gel sia completato completamente. Incubare la piastra di Petri a 37 gradi Celsius per altri 30 minuti se necessario, quindi aggiungere da quattro a sei millilitri di mezzo D-M-E-M-F 12 contenente 25 millimoli di buffer hepes e dal 15 al 20% di siero fetale bovino.

Molto delicatamente, per evitare che il mezzo fluisca direttamente sulle fette, assicurarsi che le fette non siano completamente immerse nel mezzo, lasciando la superficie delle melanzane ben esposta all'aria. Cambiare il mezzo due volte alla settimana. Incubare ora la sospensione di cellule progenitrici neurali nel mezzo con cinque micromolar di hooks.

3, 3, 3, 4, 2 per 30 minuti. Sotto un microscopio, utilizzare un capillare di vetro per microiniettare due microlitri di sospensione nella fetta di midollo spinale. Procedere lentamente, assicurandosi che il capillare di vetro penetri attraverso il matrigel e raggiunga l'interno della fetta di midollo spinale.

Mantenere il tubo di vetro all'interno della sezione del midollo spinale per almeno 30 secondi per evitare la sospensione cellulare. Procedere quindi a collocare la piastra di Petri contenente la sezione del midollo spinale nell'incubatrice a 37 gradi Celsius con 5 cent di anidride carbonica per tutta la notte. Il giorno successivo, costruire una camera elettotattica attorno alla sezione del midollo spinale contenente cellule neurali etichettate 3 3 3 4 2 prima di applicare un campo elettrico di 500 millivolt per millimetro.

Qui le cellule progenitrici neurali mostrano una migrazione fortemente diretta verso il catodo quando esposte a campi elettrici, le linee rosse e le frecce blu rappresentano rispettivamente le traiettorie e la direzione del movimento cellulare. Ecco il grafico dei percorsi di migrazione mostrati. Qui sono le cellule progenitrici neurali marcate con hooks 3 3, 3, 4 2.

Sono state trapiantate in una fetta di midollo spinale organotipica al momento dell'inizio del trattamento con campo elettrico. Dopo che le cellule progenitrici neurali hanno migrato in modo direzionale verso il catodo per 2,5 ore, la polarità del campo elettrico è stata invertita. L'inversione della polarità del campo elettrico ha innescato un brusco rovesciamento dell'asse verso il nuovo catodo.

Ecco un'immagine delle cellule progenitrici neurali trapiantate all'interno della sezione di midollo spinale. Alla fine della registrazione in time-lapse, viene mostrata una ricostruzione tridimensionale delle cellule progenitrici neurali trapiantate all'interno della sezione di midollo spinale. Mass mastered.

Questa tecnica può essere eseguita in due settimane se viene effettuata correttamente dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ora apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare la migrazione delle cellule progenitrici neurali in sistemi di coltura 2D e 3D in risposta e applicazione a un campo elettrico.