Rilevamento di ipossia microregionale nella corteccia cerebrale di topo Imaging a due fotoni di fluorescenza endogena NADH

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare direttamente l'ipossia tissutale a livello microregionale nella corteccia del topo in vivo. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando una finestra cranica aperta nel cranio di un topo anestetizzato. Successivamente, un colorante fluorescente viene iniettato per via endovenosa per etichettare i vasi sanguigni cerebrali.

Infine, viene effettuata contemporaneamente l'acquisizione fotonica della fluorescenza intrinseca del NADH e della microvascolatura corticale marcata con fluorocromo. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'ipossia funzionale in microregioni del parenchima cerebrale attraverso la visualizzazione della forma ridotta della nicotinammide adenina dinucleotide. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come gli elettrodi di tipo Clark, è che fornisce un'elevata risoluzione spaziale su un ampio campo visivo ed è anche meno invasiva.

Questo metodo può essere eseguito su un comune sistema a due fotocamere applicato con due canali fluorescenti. Ciao, sono Steve Hurst, professore e direttore del dipartimento di microbiologia e immunologia presso l'Università di Rochester; a dimostrare la procedura oggi saranno il figlio di Anita del Laboratorio Kishka, nonché Oxana Paulka, professoressa assistente di ricerca del mio laboratorio. Il dottor Kishka, che ha ideato la tecnica di imaging del NADH, non può essere presente oggi poiché si è recentemente trasferito in Germania. Dopo aver preparato il sito chirurgico con gli strumenti necessari, sterilizzati in autoclave o disinfettati con etanolo al 70%, e aver anestetizzato il topo con isoflurano al 5%, posizionarlo su un tappetino riscaldante e applicare una maschera facciale per somministrare isoflurano all'1,3-1,5% in aria.

Verificare il livello di anestesia eseguendo una compressione della coda. Successivamente, inserire una sonda rettale e misurare continuamente la temperatura corporea dell'animale durante tutta la procedura. Applicare un gel lacrimale artificiale sugli occhi del topo per evitarne l'essiccazione.

Quindi rimuovere i peli dalla testa e applicare un depilatore su entrambe le cosce per due minuti per eliminare i peli residui; la coscia verrà utilizzata per l'ossimetria. Infine, disinfettare il cuoio capelluto utilizzando una soluzione di iodopovidone al 10% e alcol al 70%. Per creare una finestra cranica, iniziare a cinque millimetri dal cranio con le forbici.

Eseguire un'incisione nel cuoio capelluto e avanzare di un centimetro. Spostare la pelle lateralmente per esporre il cranio. Rimuovere le membrane situate sulla sommità del cranio. Applicare una soluzione di cloruro ferrico al 10%.

Rimuovere la soluzione in eccesso e staccare le membrane con un angolo di 45 gradi. Punto cinque, pinzette: utilizzando un microscopio stereoscopico, identificare l'area di interesse. Applicare uno strato sottile di colla rapida lungo i bordi della finestra della piastra cranica.

Posizionare la piastra cranica in modo che l'area di interesse sia esposta nella finestra e applicare una leggera pressione sulla piastra cranica. Applicare una piccola quantità di cemento dentale per polimerizzare rapidamente la colla. Mantenere premuto per 10 secondi mentre la colla si sta polimerizzando.

Applicare una piccola quantità di colla rapida ai bordi della finestra per sigillare la piastra cranica e il cranio. Quindi avvitare la piastra cranica al supporto per l'animale sotto la lente di dissezione. Utilizzare il micro trapano a coppia regolata impostato a 6.000 giri al minuto e la punta da trapano IRF 0 0 5.

Rimuovere tutta la colla in eccesso dal cranio e dalla piastra cranica. Impostare quindi il trapano a mille giri al minuto e iniziare a trapanare il cranio eseguendo un cerchio all'interno della finestra della piastra cranica con un diametro di circa cinque millimetri. Utilizzare movimenti leggeri e ampi, come se si stesse disegnando con una matita molto morbida.

Ogni 20-30 secondi interrompere la perforazione ed utilizzare aria compressa per rimuovere la polvere ossea. Procedendo con la perforazione, si forma una cavità attorno al cranio integro al centro. Prestare attenzione a non perforare il cranio sottile, assicurandosi che la cavità abbia uno spessore uniforme.

Inoltre, prestare particolare attenzione nelle vicinanze di vasi sanguigni di grandi dimensioni. Questi non devono essere danneggiati e, se possibile, nemmeno toccati. Con una delle punte di una pinzetta, sollevare l'osso al centro della finestra e applicare una goccia di liquido cerebrospinale artificiale sulla finestra. Utilizzando l'angolo di un fazzoletto Kim, rimuovere delicatamente il liquido cerebrospinale artificiale con un angolo di 45 gradi.

Numero cinque, pinzette. Individuare una zona di dura danneggiata lungo il margine della finestra e sollevarla per rimuoverla. Se si verifica un sanguinamento, applicare una goccia di liquido cerebrospinale artificiale e attendere due o tre minuti affinché il sanguinamento di lieve entità si arresti.

Successivamente, preparare 10 millilitri di aero a basso punto di fusione allo 0,07% disciolto in liquido cerebrospinale artificiale. Portare l'aero fuso alla temperatura corporea. Rimuovere il liquido cerebrospinale artificiale in eccesso dalla superficie del cervello.

Versare l'aerogel nella finestra e coprirlo con un vetrino. Quindi premere delicatamente il vetro per stabilire il contatto tra il vetro e la piastra superiore e attendere da 10 a 20 secondi finché l'aerogel non si solidifica. Utilizzando pinzette e carta da cucina morbida, rimuovere l'eccesso di aerogel dal vetrino.

Mettere una piccola quantità di colla rapida attorno al vetro per incollarlo alla piastra cranica. Quindi applicare una piccola quantità di cemento dentale per solidificare la colla prima dell'iniezione nella vena femorale. Ruotare parzialmente l'animale per esporre la parte interna della coscia sinistra.

Utilizzare del nastro adesivo per fissare l'animale. In questa posizione, applicare una detersione antisettica e successivamente etanolo al cento per cento sulla cute. Successivamente, praticare un'incisione lungo la coscia mediale, dal ginocchio fino alla sinfisi pubica.

Se necessario, separare i tessuti molli mediante dissezione ottusa. Riempire una siringa da un millilitro con 130 microlitri di Texas red. Applicare un nuovo ago da 30 gauge e piegarlo con cura ad un angolo di 30 gradi, mantenendo il bisellino rivolto verso l'alto.

Riempire l'ago con la soluzione di Texas Red sotto un microscopio stereoscopico, inserire l'ago nella vena femorale e iniettare cento microlitri di Texas Red. Rimuovere l'ago e premere leggermente la vena con una garza per arrestare il sanguinamento. Chiudere la cute utilizzando un punto di sutura da quattro per il monitoraggio continuo della saturazione ematica di ossigeno.

Posizionare la sonda dell'ossimetro sulla coscia destra, da cui in precedenza è stato rimosso il pelo. Per iniziare l'acquisizione delle immagini, trasferire il topo preparato chirurgicamente sul palchetto del microscopio. Acquisire un'immagine iniziale del sito della finestra cranica utilizzando l'illuminazione a campo chiaro a un ingrandimento di quattro volte, da usare come mappa di riferimento per la registrazione con ingrandimenti superiori per i fotoni.

Ingrandire l'area di interesse utilizzando un ingrandimento 10x. Selezionare un'area di interesse nei livelli corticali. Uno o due iniziano a registrare la serie temporale.

Si consiglia di utilizzare una media di tre a cinque fotogrammi per migliorare la qualità dell'immagine. Successivamente, indurre ipossiemia aggiungendo il 50% di azoto all'aria che l'animale respira. Questo porterà il livello di ossigeno al 10%. Verificare l'ipossiemia monitorando i dati dell'ossimetro.

Continuare a registrare la serie temporale durante l'ipossiemia per circa 30 secondi e dopo il ripristino del livello normale di ossigeno. Raccogliere i dati per il calcolo della distribuzione dell'ossigeno rilevando, misurando e quantificando l'area di ipossia e dei cilindri di tessuto ossigenato attorno ai vasi sanguigni. Per determinare il raggio R del cilindro di tessuto croak, misurare la distanza tra il centro del vaso sanguigno e il confine in cui viene rilevata una fluorescenza elevata di NADH.

Fare riferimento al protocollo scritto per i metodi di elaborazione dei dati. Questa figura mostra immagini simultanee di NADH e geografia provenienti da un video registrato durante un'episodio di ipossiemia transitoria, in cui la concentrazione di ossigeno inspirato è stata ridotta dal 21% al 10% per un periodo di tre minuti. Questo livello di ipossiemia indotta sperimentalmente è sufficiente per indurre una grave ipossia nella corteccia cerebrale.

L'ipossia ha determinato un aumento della fluorescenza di NADH, mostrata in verde, inizialmente nelle aree più distanti dall'apporto ematico arterioso. Si notino i netti confini tissutali di NADH, che rappresentano i confini tissutali osservabili della diffusione dell'ossigeno dalla microcircolazione corticale mostrata in rosso. Qui è riportata un'immagine contemporanea dei microvasi corticali marcati fluorescentemente in rosso e della fluorescenza intrinseca di NADH dalla sostanza grigia della corteccia in verde; la distribuzione dell'intensità della fluorescenza di NADH è binaria.

Esistono aree con fluorescenza di NADH uniformemente bassa e aree con fluorescenza di NADH uniformemente alta. Le linee gialle rappresentano i confini tissutali tra le aree con fluorescenza di NADH bassa e alta. Questi confini tissutali mostrano una relazione spaziale con i microvasi circostanti.

Questa relazione è determinata dalla diffusione dell'ossigeno dai microvasi verso il tessuto. In alcuni casi, la natura cilindrica o il cilindro tessutale CRO di questi confini tessutali può essere riconosciuta direttamente, come indicato dalle linee blu. Qui, il confine del tessuto ha una forma circolare con un vaso sanguigno centrale concentrico Una volta padroneggiato.

Questa tecnica può essere eseguita in 1,5 ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di incollare il vetrino alla piastra metallica per prevenire movimenti verticali della superficie corticale dovuti all'edema. Dopo questa procedura, possono essere effettuate ulteriori analisi, come misurazioni dell'iperemia funzionale, con l'obiettivo di affrontare domande aggiuntive, ad esempio la relazione tra ipossia tissutale e accoppiamento cerebrovascolare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare l'ipossia tissutale microregionale nella corteccia del topo.