Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare l'effetto del carico meccanico sul taglio proteolitico di singole proteine in modo altamente parallelo ed economico. In questa dimostrazione, nel primo passaggio viene esaminato il taglio del collagene da parte della metalloproteasi matriciale uno; i trimers di collagene vengono fissati alla lamella di vetro di una cella a flusso, seguito dal fissaggio di microsfere magnetiche di dimensioni micrometriche alle singole molecole di collagene. Il secondo passaggio consiste nel montare la cella a flusso nell'apparato delle pinze magnetiche e verificare che le microsfere legate in modo non specifico siano state rimosse dalla superficie della lamella.

Successivamente, la proteasi viene aggiunta alle cellule a flusso. L'ultimo passaggio consiste nel determinare la velocità di proteolisi monitorando in tempo reale il distacco delle perle. Misurando le velocità di distacco delle perle a diverse concentrazioni di proteasi e forze applicate, è possibile ricavare i parametri cinetici zoologici standard utilizzando quantità minime di substrato e proteasi.

Inoltre, questa tecnica fornisce informazioni uniche sull'effetto della forza meccanica sulla velocità di proteolisi e sui cambiamenti strutturali nella proteina substrato che accompagnano il taglio. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi come le tracce ottiche T e la microscopia a forza atomica è che questa tecnica è ad alto rendimento ed economicamente vantaggiosa. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla forza efficace sul taglio proteolitico di singole proteine, lo strumento e le tecniche possono essere applicati a un'ampia gamma di problemi biofisici, inclusi l'effetto della forza sul ripiegamento e sulla conformazione delle proteine.

Iniziare la preparazione della cella a flusso pulendo i coprioggetti mediante sonificazione. Aggiungere i coprioggetti in un piccolo contenitore di vetro in grado di contenerli e adatto al bagno a ultrasuoni. Riempire il contenitore con isopropanolo e sonificare in un bagno a ultrasuoni per 20 minuti, quindi rimuovere l'isopropanolo e risciacquare i coprioggetti con abbondante acqua deionizzata.

Riempire il contenitore con acqua e sottoporlo a sonificazione per 20 minuti. Dopo la sonificazione, asciugare le coprioggetti in un flusso d'aria filtrata priva di polvere. Ispezionare le coprioggetti e utilizzare solo quelle prive di macchie.

Passare delicatamente le lamelle attraverso la fiamma di un becco Bunsen per alcuni secondi per rimuovere polvere e umidità residue. Fare attenzione a non deformare la lamella a causa di un eccesso di calore. Questo passaggio elimina i contaminanti superficiali residui.

Successivamente, utilizzare nastro adesivo trasparente doppia faccia per unire i due vetrini. Dopo aver tagliato il nastro a una lunghezza di circa tre centimetri e una larghezza di 0,3 centimetri, applicarlo su un vetrino di dimensioni 22 per 40 millimetri, lasciando un canale centrale di 1,6 centimetri. Utilizzare la punta di una pipetta per premere delicatamente sul vetrino, assicurandosi che il nastro sia correttamente aderito.

L'apparato delle pinze magnetiche è stato costruito da questo laboratorio utilizzando un supporto a L in alluminio con un foro di un millimetro di diametro, montato su un traslatore verticale Z per regolare l'altezza delle pinze. Due magneti permanenti in terre rare sono stati fissati al supporto su entrambi i lati del foro al fine di generare il gradiente del campo magnetico. Una corretta calibrazione della trappola magnetica è essenziale per questa procedura.

Per garantire il successo, utilizziamo due metodi diversi come descritto in questa sezione. Per calibrare la trappola magnetica, utilizzare il DNA precedentemente preparato dal fago Lambda, marcato alle estremità 5' e 3' con biotina e doxigenina, come descritto nel protocollo scritto. Per fissare il DNA alla cella di flusso, riempire innanzitutto la cella di flusso con soluzione di anti-doxigenina e anticorpo e lasciare che l'anticorpo aderisca alla superficie di vetro per 15 minuti.

Successivamente, satura la superficie della cella a flusso per prevenire l'adesione non specifica del DNA aggiungendo una soluzione di BSA nella cella a flusso. Nota che per questo passaggio di saturazione e per tutti i passaggi successivi, il volume del reagente aggiunto alla cella a flusso deve essere almeno doppio rispetto al volume della cella a flusso, che in questa dimostrazione è di 75 microlitri; incuba la cella a flusso a temperatura ambiente per 45 minuti.

Dopo aver ripetuto questo passaggio, aggiungere 50 pico moli di DNA lambda funzionalizzato e lasciarlo aderire al vetrino per 15 minuti, quindi rimuovere l'eccesso di DNA con un lavaggio in XPBS. Infine, aggiungere le perle superparamagnetiche ricoperte di streptavidina e lasciarle aderire al DNA immobilizzato per 15 minuti. In questa dimostrazione, vengono utilizzate perle da 2,8 micrometri.

Rimuovere le perle in eccesso con un lavaggio in XPBS. Successivamente, eseguire la calibrazione dei pinzette magnetiche spostando i magneti permanenti in una posizione lontana dalla superficie del campione. Quindi, posizionare la cella a flusso preparata nel microscopio.

Spostare i magneti permanenti in posizione sopra la cella a flusso. Scegliere il piano focale delle perle funzionalizzate con DNA Lambda mettendo a fuoco le perle lontane da entrambe le superfici di vetro. Il piano focale corretto è quello in cui le perle desiderate presentano un centro luminoso.

Registrare un video del movimento delle perline a una frequenza superiore a 80 hertz per 500 fotogrammi. Avvicinare il magnete alla superficie del campione e registrare un video del movimento delle perline a ciascuna posizione. Per distanze superiori a cinque millimetri, spostarsi a incrementi di un millimetro per distanze comprese tra uno e cinque millimetri.

Spostarsi a incrementi di 0,5 millimetri per distanze inferiori a un millimetro, spostarsi a incrementi di 0,25 millimetri. Per ogni dataset, tracciare il centro delle perline utilizzando un adattamento gaussiano 2D. Calcolare la forza mediante le fluttuazioni browniane come descritto nella procedura scritta. Verificare l'accuratezza delle forze controllando il calcolo della forza tramite un adattamento spettrale di potenza di Lian.

Per determinare la frequenza di distacco, la relazione tra forza applicata e frequenza di distacco può essere individuata nel testo precedente all'attacco del peptide di collagene alle cellule di flusso, esprimere e purificare il peptide di collagene e le proteine MMP1. Iniziare aggiungendo la soluzione di anticorpo anti-MIC alla cella di flusso e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti, in modo da permettere all'anticorpo anti-MIC di legarsi alla superficie della cella di flusso. Bloccare la cella di flusso per prevenire l'attacco non specifico delle proteine utilizzando BSA a 5 milligrammi per millilitro. Aggiungere 150 picomolari di peptide di collagene e lasciarlo legare all'anticorpo tramite il marcatore M1 per 45 minuti.

Lavare via l'eccesso di collagene utilizzando tampone PBS prima di aggiungere le microsfere di 2,8 micrometri alla cella di flusso. Queste devono essere separate dalla soluzione di microsfere rivestite con streptavidina mediante magneti potenti, quindi risospese in PBS. Questo processo deve essere ripetuto tre volte.

Questo passaggio è essenziale per permettere ai microsfera di 2,8 micrometri di legarsi al peptide di collagene immobilizzato sulla superficie. Successivamente, aggiungere microsfera superparamagnetiche ricoperte di streptavidina e lasciarle attaccare alle molecole di collagene per 45 minuti. Una volta assemblata la cella a flusso con il peptide di collagene e le microsfera magnetiche, acquisire un'immagine della cella a flusso nella trappola magnetica.

Sotto una forza ridotta, una sottopopolazione delle perle è talvolta debole, aderente alla superficie in modo non specifico. L'applicazione di una forza moderata garantisce che queste perle vengano rilasciate. Aggiungere l'enzima attivato alla cella di flusso.

In questo caso, la MMP uno è stata preattivata aggiungendo 3,5 millimolari di PMA e incubata a 37 gradi Celsius per tre ore. Non appena una cella a flusso viene reintrodotto nell'apparato di pinze magnetiche, registrare un video che comprenda alcuni campi visivi, ottenendo tipicamente alcune centinaia di microsfere legate. Questa misurazione corrisponde a tempo uguale a zero.

Ripetere lo stesso processo di acquisizione di diversi campi visivi a intervalli di tempo regolari fino a quando tutte le perle si staccano o non si osserva ulteriore proteolisi. I pinzette magnetiche sono state calibrate per perle di un micrometro e di 2,8 micrometri. Utilizzando sia l'entità delle fluttuazioni browniane osservate sia il calcolo della frequenza di attenuazione in corrispondenza di diverse posizioni del magnete negli esperimenti di proteolisi forzata, è possibile tracciare il numero normalizzato di perle rimanenti in funzione del tempo per determinare la velocità di proteolisi.

E questo processo può essere ripetuto con diverse concentrazioni di enzimi e forze. I tassi di proteolisi dipendono dalla forza applicata. I tassi di proteolisi sono stati determinati a uno piconewton, 6,2 piconewton e 13 piconewton.

La frazione di perle non legate, per tempi superiori a 15 minuti, rimane approssimativamente costante a 0,25 in diversi esperimenti. Nel nostro caso, il saggio ci ha permesso di misurare l'efficienza catalitica della MMP uno in funzione della forza applicata. Analizzando i dati, abbiamo scoperto che l'elica tripla del collagene deve svolgersi localmente prima della proteolisi.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque-sei ore se svolta correttamente. È importante ricordare che sono necessarie almeno 30-50 perline per campo visivo per ottenere una buona significatività statistica dei dati. Non dimenticare che un PMA può essere estremamente pericoloso e che durante l'esperimento è sempre necessario adottare precauzioni come l'uso di guanti, camici da laboratorio e maschere facciali.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare l'effetto della forza sul taglio proteolitico di singole proteine utilizzando pinze magnetiche. Le pinze magnetiche sono uno strumento eccellente per comprendere esperimenti biofisici a livello di singola molecola. Questa tecnica può essere estesa ad altre combinazioni di proteasi e substrato.

Inoltre, tecniche simili possono essere utilizzate per comprendere la dinamica strutturale delle proteine, nonché per studiare altre proteine che si legano o modificano l'RNA e/o il DNA.