Ripiegamento di analisi intracellulari

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare il ripiegamento intracellulare delle proteine dipendente dalle chaperone dopo uno shock termico. Utilizzando un reporter della luciferasi, trasfettare innanzitutto le cellule con plasmidi contenenti il gene reporter della luciferasi e la chaperona di interesse. Successivamente, suddividere le cellule trasfettate in diversi punti temporali di recupero secondo il disegno sperimentale.

Il giorno successivo, sottoporre le cellule a shock termico per indurre lo svolgimento delle proteine. Consentire il recupero per ripristinare il ripiegamento intracellulare delle proteine, quindi misurare l'attività del reporter luciferasi. I risultati misurano il ripiegamento proteico dipendente dal tempo e dalle chaperone, basandosi sul saggio della luciferasi.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio di ripiegamento in vitro, è la possibilità di ottenere un'osservazione fisiologica diretta dell'effetto di composti o proteine sull'attività delle chaperone. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di un'ampia gamma di malattie, come le malattie neurodegenerative o il cancro, poiché le chaperone svolgono un ruolo importante nello sviluppo di queste patologie. Per prima cosa, preriscaldare il mezzo di coltura, il PBS e la tripsina a 37 gradi Celsius in un bagno termico.

Lavare una coltura confluenziale di cellule HEK 293 con cinque millilitri di PBS. Quindi aggiungere un millilitro di tripsina contenente 0,025% di EDTA, ruotare delicatamente la piastra per una distribuzione uniforme della tripsina e incubare a 37 gradi Celsius. Agitare periodicamente la piastra per verificare il distacco delle cellule.

Ora sospendere le cellule in 10 millilitri di mezzo DMEM completo e trasferirle in un tubo falcon da 50 millilitri. Quindi enumerare le cellule utilizzando una piastra Beckman counter. Le cellule devono raggiungere una confluenza di circa il 60-70% e incubare per sei-otto ore.

Portare l'extreme gene nine reagent e un'aliquote di mezzo senza siero a temperatura ambiente e riscaldare il mezzo senza siero a 37 gradi Celsius. Pipettare il mezzo senza siero in due provette einor. Quindi aggiungere l'extreme gene nine reagent senza toccare le pareti della provetta einor e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.

Nel frattempo, preparare le miscele di trasfezione 2D NA nel tubo uno, aggiungere ran vanilla firefly e un controllo con vettore vuoto nel tubo due. Aggiungere ran vanilla firefly e il chaperone molecolare. Aggiungere il DNA alla miscela del reagente per trasfezione, vortexare e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.

Continuare ad aggiungere questa miscela sulle cellule in piastra e incubare per 24 ore. Raccogliere le cellule transfezionate utilizzando tripsina, seminare le cellule al 60-70% di confluenza in piastre a sei pozzetti e lasciarle nell'incubatrice tutta la notte. Aspirare il mezzo dalle cellule transfezionate.

Quindi aggiungere un millilitro di buffer per il trattamento termico e incubare per 30 minuti. Per arrestare la sintesi proteica *de novo*, sigillare i coperchi con strisce di paraform e incubare in un bagno termico a 45 gradi Celsius per 30 minuti. A questo punto rimuovere il paraform e riposizionare le cellule nell'incubatore per il recupero nei punti temporali specificati.

Raccogliere le cellule e lavarle una volta in PBS. Per una lisi cellulare efficiente, congelare rapidamente il pellet cellulare in azoto liquido, quindi aggiungere 200 microlitri di buffer di lisi passivo diluito. Aliquotare ora in triplicato, utilizzando 30 microlitri di lisato cellulare per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.

Per valutare l'efficienza di trasfezione, iniziare dai campioni di riferimento non sottoposti a shock. Per misurare l'attività della ran luciferasi, preparare un buffer di reazione fresco contenente 0,2 millimoli di Lucifer in buffer gly Gly con 1 millimole di A TP e 0,2 micromoli di ezine. Inserire la piastra a 96 pozzetti nel luminometro e avviare il programma.

Stazione di lavoro Wallach 1420. Inserire la pompa uno nel tubo Falcon contenente tampone di reazione con ezina 0,2 micromolare. Dal menu, selezionare l'opzione manutenzione erogatore e selezionare la pompa uno.

Selezionare l'opzione fill per modificare il layout della piastra. Scegliere l'opzione, esplorare il protocollo e i risultati nel menu. Selezionare il protocollo.

Ora selezionare le pozzette da leggere. Tornare al gestore Wallach e fare clic su start per misurare le emissioni del campione. A 482 nanometri, procedere alla manutenzione del dispenser e selezionare svuota e pompa uno per rilasciare tutta la soluzione residua nuovamente nel tubo.

Ora spostare la provetta in un falcone contenente acqua e tampone, quindi eseguire il lavaggio. Procedere selezionando "vuoto". Successivamente, posizionare la provetta della pompa uno nel tampone di reazione e quella della pompa due nella soluzione di LUCIFERINA.

Modificare il layout della piastra. Selezionare il riempimento per la pompa uno e la pompa due. Dal menu di manutenzione del dispensatore, selezionare il protocollo e iniziare a misurare la lunghezza d'onda della reazione della luciferasi della lucciola a 560 nanometri.

Alla fine del ciclo ripetuto, ripetere la procedura: svuotare, sciacquare, svuotare. Per la pompa uno e la pompa due, visualizzare i risultati nell'Wallach 1420 Explorer. A ogni esperimento è associato un saggio.

Numero di nome utente, date di inizio e fine, esporta i risultati come file Excel. Per l'analisi, il ripiegamento delle proteine è direttamente correlato al tempo di recupero. In questo esperimento, le cellule vengono valutate in diversi punti temporali dopo lo shock termico.

In assenza e in presenza di chaperone molecolare. Come previsto, la percentuale di luciferasi ripiegata aumenta con il prolungarsi del tempo di recupero sia nei controlli che nelle cellule trasfettate con il chaperone molecolare. Al contrario, un dataset non valido mostra bassi valori di R quadrato per la correlazione tra tempo e ripiegamento.

Seguendo questa tecnica, possono essere eseguiti altri metodi come il saggio TPA in vitro al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio sull'inibizione dell'attività enzimatica della chaperona. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare le proteine intracellulari. Noi seguiamo dopo lo shock termico.