Calcio Imaging funzionale nello sviluppo di reti corticali

L'obiettivo generale di questo filmato è dimostrare come misurare l'attività di rete in fette cerebrali corticali in sviluppo utilizzando un indicatore fluorescente sensibile al calcio. Le fette cerebrali di topo giovane (DY) sono ottenute dalla corteccia enterica in sviluppo di un topo giovane. Sia i neuroni che gli astrociti vengono caricati con marcatori dipendenti dal calcio.

Le variazioni della fluorescenza di coloranti sensibili al calcio riflettono i cambiamenti nell'attività cellulare. Le cellule non neuronali, inclusi astrociti, microglia e cellule endoteliali, possono essere colorate utilizzando specifici coloranti marcatore. L'attività della rete corticale viene registrata mediante acquisizione temporale con microscopia a due fotoni; le cellule vengono individuate all'interno della rete creando uno stack tridimensionale di immagini attraverso la regione di interesse.

Le variazioni della fluorescenza cellulare in più cellule possono quindi essere analizzate per rilevare l'attività della rete corticale in via di sviluppo. Un modello caratteristico di attività nel sistema nervoso in via di sviluppo è l'attività spontanea sincronizzata della rete. L'attività sincronizzata è stata osservata in molte diverse regioni neuronali in sviluppo, inclusi il midollo spinale intatto, la corteccia e preparazioni di colture neuronali dissociate durante periodi di attività spontanea, in cui i neuroni, depolarizzati fino a generare scariche, producono singoli potenziali d'azione o raffiche di potenziali d'azione che attivano molti canali ionici, tra cui i canali del calcio attivati dal voltaggio, determinando un afflusso di calcio.

Un'attività altamente sincronizzata è stata misurata in reti locali mediante l'uso di elettrodi di campo o matrici di microelettrodi. Questi strumenti consentono elevati tassi di campionamento temporale, ma offrono una risoluzione spaziale inferiore a causa della lettura integrata dell'attività cellulare. La risoluzione a livello di singola cellula dell'attività neuronale è possibile mediante la tecnica di patch clamp elettrofisiologico su singoli neuroni per misurare le frequenze di scarica.

Tuttavia, la capacità di effettuare misurazioni da una rete è limitata al numero di neuroni registrati simultaneamente, ed è tipicamente di uno o due neuroni. L'utilizzo di coloranti fluorescenti sensibili al calcio ha permesso di misurare l'attività sincronizzata attraverso una rete di cellule. Questa tecnica offre sia un'elevata risoluzione spaziale sia un campionamento temporale sufficiente per registrare l'attività spontanea della rete in sviluppo.

Gli indicatori fluorescenti sensibili al calcio, come l'estere URA 2:00 AM, contengono gruppi acidi carbossilici in grado di legare gli ioni calcio. Questi coloranti fluorescenti vengono attivati da specifiche lunghezze d'onda della luce, mediante microscopia a un fotone o a due fotoni. Il numero di fotoni emessi dal colorante viene temporaneamente modificato in seguito al legame con il calcio.

Questa variazione nel numero di fotoni o nella fluorescenza viene riportata come segnale delta FF e corrisponde a un cambiamento del livello di calcio all'interno del neurone. La misurazione delle variazioni negli indicatori sensibili al calcio costituisce una misura utile per valutare i modelli di attività della rete nelle cellule in via di sviluppo. Ciao, sono Rianna Morty, e il mio nome è Julie Abbots.

Siamo del Dipartimento di neurofisiologia interpretativa e dell'università di Amsterdam. Stiamo utilizzando l'imaging del calcio per studiare l'attività funzionale nei tessuti in via di sviluppo della corteccia del topo, impiegando indicatori sensibili al calcio in combinazione con l'imaging multifocale. L'obiettivo di questo breve filmato è mostrare come questi metodi possano essere utilizzati per misurare sia i modelli di attività spontanea che quelli evocati nelle reti in sviluppo del sistema nervoso.

Rimuovere rapidamente il cervello dal cranio di un topo giovane per ridurre i danni alla circuitazione neurale. Dissezionare il cervello in soluzione fredda per sezioni. La soluzione per sezioni contiene cloruro di colina invece del sodio comunemente usato nell'ASFT per le registrazioni neuronali.

In questi esperimenti, stiamo preparando sezioni cerebrali dalla corteccia enterale del cervello del topo in via di sviluppo. Posizionare un pezzo di carta da filtro sopra una piastra di Petri e inumidirlo con alcuni millilitri di A TSF. Trasferire il cervello sul pezzo di carta da filtro.

Dividere gli emisferi utilizzando una lama di rasoio monouso. Separare i due emisferi. Riposizionare uno di essi nella soluzione di taglio ghiacciata insieme all'emisfero rimanente.

Rimuovere il cervelletto con la lametta. Girare un emisfero sul suo piano mediano ed effettuare un taglio di circa un millimetro dalla superficie dorsale, con un lieve angolo della lama verso l'estremità rostrale. Rivoltare il cervello sull'altro lato.

La sua superficie appena tagliata utilizzando un bastoncino di cotone e una spatola metallica. Trasferire il cervello sul blocco metallico per il taglio. Spingere delicatamente il cervello dalla spatola sulla superficie incollata utilizzando un bastoncino di cotone.

Si eseguono sezioni cerebrali di 300 micrometri; per il tessuto giovane, le velocità di taglio e la frequenza della lama sono tipicamente più basse rispetto a quelle utilizzate per tessuti più maturi. Una volta sezionate, si trasferiscono ogni sezione utilizzando una pipetta di vetro; le sezioni vengono trasferite nella camera di mantenimento, contenente A TSF ossigenata a temperatura ambiente. L'A CSF contiene un rapporto maggiore di magnesio rispetto al calcio rispetto alla soluzione A CSF.

Si lasciano riposare per un'ora le fette utilizzate per la registrazione, affinché si riprendano. Per caricare le cellule con un indicatore dipendente dal calcio o con un marcatore specifico per cellula, è necessario trasferire le fette in una camera per la procedura di colorazione. Sebbene siano disponibili camere commerciali, è possibile assemblarne facilmente una utilizzando attrezzature di laboratorio standard a un costo molto ridotto.

Per realizzare una camera di colorazione, saranno necessari i seguenti strumenti di laboratorio di base: due piastre di Petri in plastica, una siringa da 10 millilitri, un tratto di tubo in silicone, un inserto per coltura cellulare con membrana semipermeabile, colla istantanea, tre connettori tubo di piccole dimensioni e un ago sottile. Prendete la piastra di Petri grande e praticate un piccolo foro con una bacchetta riscaldata attraverso la parete laterale. Prendete la piastra di Petri piccola e fate un foro di diametro simile, abbastanza grande da far passare il tubo in silicone.

Fare passare una sezione di tubo in silicone attraverso il foro e formare un'ansa all'interno della piccola capsula. Utilizzare colla istantanea per sigillare l'estremità aperta del tubo. Quindi attaccare la parte rimanente del tubo alla parete interna della piccola capsula di Petri.

Posizionare la piccola piastra di Petri al centro di quella grande e incollarla in posizione. Prendere l'estremità rimanente del tubo di silicone e farla passare attraverso il piccolo foro nella parete laterale della piastra di Petri. Prendere un ago sottile e praticare dei piccoli fori nel tubo di silicone all'interno della piastra di Petri.

Praticare fori a intervalli regolari per favorire una fusione uniforme dei gasper. Prelevare una pozzetta per colture cellulari con membrana semipermeabile utilizzando un bisturi riscaldato. Rimuovere il centimetro superiore della pozzetta per ottenere un contenitore basso in cui collocare le sezioni durante l'incubazione.

Posizionare la ciotola bassa al centro della ciotola piccola, circondata dal tubo di silicio poroso. Praticare un foro di diametro compreso tra mezzo e un centimetro circa nel coperchio della ciotola grande. Prendere una siringa di plastica da 10 millilitri utilizzando un bisturi riscaldato.

Eseguire un taglio obliquo per rimuovere l'estremità della siringa. Applicare colla istantanea sulla superficie tagliata del tubo della siringa. Fissare direttamente questa parte sopra il foro nel coperchio della grande piastra di Petri.

Collegare un connettore per tubo all'estremità della punta della siringa. Posizionare la piastra bassa al centro della piccola capsula di Petri assicurandosi che il tubo poroso per gas sia disposto intorno alla piastra. Questo tubo viene quindi collegato a una fonte di gas carbogeno per ossigenare le fette.

Durante l'incubazione, sostituire il coperchio della piastra grande, che è anch'esso collegato direttamente alla sorgente di gas attraverso la punta della siringa. Questo permette di fornire continuamente gas car e gas sulle sezioni durante l'incubazione, evitando il fotoblanco del colorante. Tutte le operazioni vengono eseguite con la minima luce possibile, e sia il colorante che le sezioni vengono mantenuti al buio.

Riempire la camera di colorazione con circa un millilitro e mezzo di A TSF prelevato dal supporto per sezioni. Posizionare all'interno la camera a interfaccia e aggiungere un altro millilitro di A TSF. È fondamentale mantenere un adeguato apporto di ossigeno per conservare il tessuto in buone condizioni e garantire un efficace carico della sezione.

La colorazione avviene a circa 35 gradi C per favorire l'assorbimento del colorante nei neuroni mentre la camera di colorazione si riscalda. Preparare il colorante indicatore per fira 2:00 AM Ester. Aggiungere nove microlitri di DMSO con un microlitro di acido onico a un flaconcino da 50 microgrammi.

DMSO e acido onico. Agiscono come agenti permeabilizzanti per consentire al colorante di essere assorbito attraverso la membrana lipidica. Vortexare il vial per 15 minuti per assicurarsi che il colorante sia completamente disciolto.

Per la colorazione, trasferire ciascuna sezione nell'interfaccia. Inserirla nella camera di colorazione. Applicare direttamente il colorante sulla regione di interesse sopra le sezioni e chiudere il coperchio della camera di colorazione.

Lasciare le sezioni in incubazione al buio per 20-40 minuti, a seconda dell'età del maus utilizzato. Al termine dell'incubazione, trasferire le sezioni nuovamente nel portasezioni per rimuovere l'eccesso di colorante residuo. I protocolli di colorazione per l'imaging del calcio possono essere adattati anche per tessuti più vecchi.

Questo richiede un passaggio aggiuntivo di pre-incubazione. Trasferire le vecchie sezioni in una piastra bassa di pre-incubazione contenente tre millilitri di soluzione CSF e otto microlitri di soluzione crema four allo 0,5%. Riscaldare a 35 gradi C per tre minuti. Successivamente, trasferire le sezioni nell'interfaccia, inserirle nella camera di colorazione e seguire le normali procedure di colorazione.

È inoltre possibile colorare queste sezioni per cellule non neuronali, vale a dire astrociti, microglia e cellule endoteliali. Il colorante Sulfur Rumine 1 0 1 può essere utilizzato per la colorazione degli astrociti mediante sulfur domine. Preparare una soluzione di 10 micromolare e aggiungere con pipetta il colorante viola sulla regione di interesse nelle sezioni.

Lasciare in incubazione per un periodo di 15 minuti. Trasferire le sezioni nuovamente nella camera di mantenimento per rimuovere qualsiasi colorante in eccesso. Il coniugato FSE della lectina del pomodoro può colorare le microglia e le cellule endoteliali.

Per la lectina del pomodoro, preparare una soluzione di 20 microgrammi per millilitro. Applicare il colorante sulla regione di interesse nelle sezioni. Lasciare le sezioni in incubazione per un periodo di 45 minuti.

Quindi trasferire nuovamente le sezioni nella camera di mantenimento. Durante l'acquisizione delle immagini, le sezioni devono rimanere stabili sotto il microscopio. Solitamente viene posizionata una rete metallica per trattenere il tessuto, tuttavia questa può deformare in modo non uniforme la superficie della sezione, determinando un campo visivo limitato in fuoco che è necessario evitare durante l'imaging.

Queste sezioni vengono fissate alla camera di registrazione utilizzando una soluzione di POLIETILENE o PEI. Il PEI è un polimero utilizzato per migliorare l'adesione delle cellule a una superficie per almeno un'ora. Prima di posizionare le sezioni nelle camere di registrazione, riempire queste camere con alcuni millilitri di soluzione di PEI in modo da coprire il fondo della camera.

Per prima cosa, risciacquare via la PEI dalla camera con acqua distillata, seguito da una soluzione di CSF trans. Trasferire una sezione nella camera di registrazione e rimuovere l'eccesso di soluzione di CSF. Posizionare la sezione al centro della camera utilizzando un pennello fine.

Rimuovere tutto il CSF A rimanente utilizzando piccoli pezzi di carta filtrante assorbente. Prestare attenzione per assicurarsi che la sezione non abbia CSF A lungo i bordi. Infine, aggiungere delicatamente mezzo millilitro di CSF A sulla sezione senza staccarla dalla camera.

Posizionare le camere in un grande contenitore interfaccia ossigenato e lasciarle per un'ulteriore ora al buio. Le variazioni nei coloranti indicatori sensibili al calcio possono essere registrate mediante microscopia a uno o due fotoni. Utilizziamo un laser al titanio-safiro abbinato a un microscopio Olympus per consentire l'imaging a due fotoni nelle nostre reti neuronali.

Inoltre, utilizziamo un sistema ottico per taglio L Vision biotech dotato di una telecamera EM CCD hammer MATSU per aumentare le velocità di scansione delle immagini. Posizionare la camera per fette sotto il microscopio con un flusso stabile di A-T-S-F-A-T-S-F ossigenato contenente 1,6 millimolare di calcio e 1,5 millimolare di magnesio. Il preparato viene riscaldato a circa 30 gradi C nell'apparato utilizzando luce bianca.

Individuare la regione di interesse nella sezione e mettere a fuoco sulla superficie. Spegnere le luci e chiudere la porta dell'armadio di registrazione. Per ridurre i livelli di luce di fondo.

Sono disponibili molti pacchetti software commerciali o open source per acquisire e analizzare immagini. Nel nostro laboratorio, utilizziamo il software Inspector di Lavis Biotech. Per iniziare l'acquisizione, selezionare la modalità della telecamera CCD per il rilevamento. Impostare la lunghezza d'onda appropriata per il vostro indicatore.

Per fira 2:00 AM Ester, impostare l'eccitazione a 820 nanometri nel software trim scope. Selezionare la modalità di scansione 64 B. Scegliere la dimensione ottimale del campo visivo e la risoluzione dei pixel per la propria regione di interesse.

Selezionare una frequenza di acquisizione adeguata e la rotazione dei pixel, se necessario, per il campionamento delle immagini. Aprire lo scatto del laser per iniziare l'acquisizione continua. Utilizzare la modalità di acquisizione continua.

Regolare il guadagno e l'intensità del laser e mettere a fuoco la rete neuronale che si desidera acquisire. Arrestare la scansione. Selezionare le impostazioni per l'acquisizione in time-lapse, specificando la frequenza dei fotogrammi e la durata della sequenza.

Dopo l'acquisizione con imaging a intervalli di tempo, effettuare uno stack Z di immagini che copra 20 micron sopra e 20 micron sotto, con passi di un micron. Questo stack Z viene utilizzato per il rilevamento delle cellule durante l'analisi. Esportare i file registrati come uno stack di immagini TIFF.

In conclusione, abbiamo illustrato l'uso di indicatori del calcio per misurare l'attività spontanea sincrona della rete neurale nel cervello in via di sviluppo. Ulteriori dettagli sulla metodologia e sui reagenti sono disponibili nei fogli informativi allegati a questo filmato, che consentiranno di implementare la tecnica nel proprio laboratorio.