Analisi quantitativa della migrazione casuale di celle usando Time-lapse Microscopia Video

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare quantitativamente la migrazione cellulare in tempo reale mediante microscopia video con intervallo di tempo. Questo viene ottenuto innanzitutto ricoprendo una piastra da coltura a sei pozzetti con collagene, quindi seminando raramente le cellule di interesse sulla piastra rivestita. Come secondo passaggio, si crea una ferita nella piastra utilizzando la punta di una pipetta, assicurando uno spazio adeguato per la migrazione.

Successivamente, si allestisce il microscopio e si acquisiscono immagini a intervalli regolari utilizzando un sistema di controllo della temperatura, che consente il monitoraggio continuo in tempo reale delle cellule in migrazione. Infine, si utilizza il protocollo di tracciamento delle particelle per valutare le differenze nella velocità media e nello spostamento totale delle cellule test e di controllo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio di migrazione in camera evitante, è che non si basa su misurazioni quantitative della migrazione effettuate a fine esperimento.

Invece, consente il monitoraggio e il calcolo continuo di diversi parametri. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia del cancro, ad esempio come determinati geni o farmaci influenzino la migrazione delle cellule tumorali. Due giorni prima della procedura, aggiungere 1,5 millilitri di collagene diluito in opti media in ciascun pozzetto di una piastra da coltura a sei pozzetti, quindi incubare la piastra tutta la notte a quattro gradi Celsius un giorno prima della procedura.

Risospendere le cellule di interesse in due millilitri di DMEM aggiunto di FBS per pozzetto e trasferire le cellule in ciascun pozzetto della piastra rivestita con collagene ENC, incubando le cellule tutta la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno della procedura, utilizzare la punta di una pipetta per creare una ferita nelle cellule coltivate durante la notte e lavare ogni pozzetto con PBS per rimuovere eventuali detriti formatisi a seguito della ferita.

Aggiungere DMEM più FBS nei pozzetti risciacquati e quindi osservare al microscopio per confermare che sia stato creato uno spazio privo di cellule. Dopo aver acceso la fotocamera del microscopio e l'apparato per l'immagineggiamento cellulare in tempo reale, posizionare la piastra sul tavolino del microscopio. Coprire la piastra con la nuova camera di controllo ambientale per cellule vive e impostare il termostato a 37 gradi Celsius e la concentrazione di anidride carbonica al 5%. Aprire ora il software SlideBook dalla barra del menu.

Selezionare il controllo del fuoco facendo clic sul pulsante F all'interno di un cerchio. Nella casella dell'obiettivo, utilizzare la finestra a discesa per definire l'obiettivo. Nella casella del set di filtri, selezionare le impostazioni per indirizzare il percorso della luce verso il pezzo I. Selezionare il filtro appropriato per l'illuminazione in campo chiaro, quindi fare clic su Apri Campo Chiaro.

Aprire lo sportello del campo luminoso. Selezionare ora il filtro del campo luminoso sulla torretta e osservare il campione attraverso l'oculare per individuare i campi appropriati e mettere a fuoco il campione. Successivamente, ruotare la torretta dei filtri per deviare il percorso della luce verso la fotocamera. Per l'acquisizione delle immagini nel software del libro di vetrini, fare clic sul controllo di messa a fuoco, selezionare XY per scegliere diverse posizioni attraverso l'oculare, quindi fare clic su "set point" per confermare ciascuna posizione.

Per l'acquisizione dell'immagine, regolare manualmente la messa a fuoco dell'immagine della telecamera visualizzata sullo schermo, quindi utilizzare gli strumenti nella finestra di controllo della messa a fuoco per regolare la posizione Z del palco. Per ottenere i migliori risultati, effettuare la messa a fuoco su protrusioni cellulari piatte vicine al contatto con la piastra, in modo da facilitare la messa a fuoco. Utilizzare il cursore per regolare i tempi di esposizione in un intervallo appropriato per la messa a fuoco.

Se sono state selezionate più posizioni XY, regolare il fuoco per ciascuna posizione individualmente selezionando il controllo del fuoco. Quindi xy, quindi visita punto. Nel libro delle diapositive, selezionare l'immagine della fotocamera dalla barra del menu, selezionare il tipo di acquisizione e quindi time lapse per impostare la durata dell'esperimento.

Dal menu a discesa, inserire il ritardo desiderato tra l'inizio di un punto temporale e l'inizio del successivo. Nei campi dell'intervallo, il terzo campo verrà calcolato automaticamente in base ai valori inseriti manualmente. Nella sezione acquisizione XY multipla, selezionare l'elenco multipunto per esperimenti con più di una posizione XY.

Infine, assegnare un nome al file per salvarlo, andare al controllo di acquisizione e selezionare Avanzato, quindi Spool. Successivamente acquisire nella memoria e salvare nel file spool dopo ogni punto temporale. Iniziare facendo clic su Immagine.

Nella barra del menu del libretto di diapositive, selezionare importa dal menu a tendina, quindi fare clic su bobina del libretto di diapositive. Selezionare i file del libretto di diapositive desiderati generati dall'esperimento di migrazione per diversi campi e punti temporali. Aprire il primo file, quindi selezionare maschera sulla barra del menu e scegliere protocollo di tracciamento delle particelle dal menu a tendina.

Sotto il menu di tracciamento delle particelle, scegliere il protocollo di tracciamento manuale delle particelle. Apparirà una finestra con i punti temporali iniziale e finale. Per analizzare la migrazione casuale, selezionare la maschera e quindi il protocollo di tracciamento delle particelle. Ancora una volta, per determinare le coordinate del centro dell'oggetto, selezionare centro dell'area.

Quindi fare clic su traccia e continuare. Ora scegliere le statistiche desiderate per ogni percorso, come lo spostamento e la velocità media. Come mostrato qui, fare clic su calcola per visualizzare le statistiche.

Un esempio di analisi della migrazione casuale quantificata in termini di velocità è mostrato in questa casella. Nel grafico a barre, in questo esperimento, si è osservato un aumento della velocità media nelle cellule M-D-A-M-B 2 31 con il gene soppressore tumorale silenziato. Rispetto alle cellule M-D-A-M-B 2 31 di controllo mostrate qui, la migrazione casuale delle cellule della prima figura è stata analizzata in termini di spostamento cellulare.

Anche in questo caso, il gruppo con silenziamento genico totale del gene soppressore tumorale ha mostrato uno spostamento cellulare aumentato rispetto al controllo M-D-A-M-B 2 31. Le cellule in questo filmato di microscopia a tempo di posa, controllo MDA MB 2 31, erano state seminate sul collagene per tutta la notte. Le immagini sono state quindi acquisite a intervalli di un'ora per un totale di 18 ore durante la migrazione casuale.

Osservare come le cellule si allontanano dalla loro posizione originale nel tempo. In questo filmato, è stata registrata e analizzata la migrazione delle cellule test M-D-A-M-B 2 31 dopo l'adesione notturna su collagene. Si noti che le cellule test sono più migratorie rispetto alle cellule di controllo nel filmato precedente.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'invasione cellulare e la dynas per rispondere a ulteriori domande, ad esempio quali sono i ruoli delle cellule nella metastasi tumorale dopo il suo sviluppo? Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare la migrazione cellulare utilizzando linee cellulari tumorali isolate.