Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale

Questa dimostrazione ha lo scopo di ottenere immagini di proteine marcate con fluorocromo in cellule vive all'interno di una matrice 3D. In primo luogo, generare linee cellulari stabili che esprimono proteine marcate con fluorocromo. Seminare queste cellule in una matrice di collagene 3D, quindi acquisire immagini in time-lapse di cellule in migrazione mediante un microscopio confocale.

In definitiva, i risultati chiariscono la localizzazione e la dinamica delle proteine all'interno di cellule in migrazione mediante imaging a intervalli di tempo e analisi delle proteine fluorescenti, osservando la dinamica e la localizzazione proteica in 3D e in tempo reale. Offre un approccio per affrontare domande fondamentali sulla migrazione cellulare, ad esempio: come vengono regolati i contatti adesivi da parte delle proteine citoplasmatiche?

E inoltre, come vengono perturbati questi contatti da inibitori specifici. In una cultura di cellule in una piastra da 35 mm a una confluenza dell'80-90%, trasfettare le cellule con il plasmide di interesse utilizzando lipo 2000 seguendo le istruzioni del produttore. Successivamente, collocare le cellule in un incubatore.

Il giorno successivo, suddividere le cellule in due piastre di Petri da 150 mm e incubare durante la notte. Rinnovare il mezzo aggiungendo 50 microgrammi per millilitro di G418. Continuare la coltura in presenza di selezione antibiotica per due settimane.

Esaminare la coltura alla ricerca di colonie resistenti alla G quattro 18. Quindi, utilizzando un microscopio fluorescente invertito, identificare e contrassegnare le colonie positive per GFP.

Lavare le cellule due volte con PBS. Dopo il secondo lavaggio, lasciare uno strato sottile di liquido per evitare che le cellule si secchino per ciascuna colonia marcata. Pulire il più vicino possibile ai bordi con un bastoncino di cotone sterilizzato e pipettare 10 microlitri di tripsina sulla colonia.

Ripetere rapidamente per ogni colonia. Quindi incubare la piastra a 37 gradi centigradi per il distacco cellulare. Verificare l'aspetto rotondeggiante al microscopio.

Aggiungere 10 microlitri di tripsina su ciascuna colonia, pipettare per staccare completamente le cellule dalla piastra. Successivamente, trasferire ciascuna colonia di cellule in un singolo pozzetto di una piastra da coltura a 24 pozzetti per amplificare le colonie stabili. In seguito, valutare l'espressione proteica delle colonie mediante western blot standard e immunofluorescenza.

Espandere le linee cellulari selezionate modificando la superficie del vetro. La piastra inferiore consente un'ottimale legatura del collagene. Pipettare 300 microlitri di soluzione di silanizzazione sulla porzione di vetro di ogni piastra P 35 con apertura di 10 millimetri.

Incubare per un'ora a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione e lavare con acqua filtrata tre volte per 10 minuti ciascuna. Rimuovere l'acqua e posizionare le piastre su una piastra riscaldata a 50 gradi centigradi per 1,5 ore.

Posizionare i coperchi delle piastre leggermente spostati rispetto alla piastra per permettere l'essiccazione. Dopo che le piastre si sono raffreddate, pipettare 300 microlitri di soluzione di glutaraldeide al 2% sulla parte in vetro di ciascuna piastra. Incubare per un'ora, quindi lavare con PBS 3 volte per 10 minuti ciascuna.

Procedere alla sterilizzazione delle piastre mediante esposizione alla luce UV per un'ora. Innanzitutto, centrifugare 100 microlitri di particelle traccianti fluorescenti per formare un pellet. Rimuovere il liquido e risospendere le particelle in 500 microlitri di mezzo.

Eseguire cinque lavaggi, quindi risospendere le particelle in 30 microlitri di mezzo. Successivamente, raccogliere le cellule che esprimono GFP utilizzando la tripsina e preparare una sospensione di 2 milioni di cellule per millilitro in un tubo einor. Pipettare 240 microlitri di mezzo di crescita. Aggiungere 12,6 microlitri di HEPS 1 M, 20 microlitri di acqua filtrata, 50 microlitri di soluzione cellulare e 10 microlitri delle particelle fluorescenti.

Infine, aggiungere 167 microlitri di collagene del derma bovino e mescolare accuratamente la soluzione. Trasferire ora 80 microlitri sulla parte in vetro della piastra silanizzata preparata. Incubare a 37 gradi centigradi per 50 minuti per consentire la polimerizzazione del gel.

Quindi aggiungere con attenzione due millilitri di terreno di crescita. Portare la camera del microscopio a una temperatura costante di 37 gradi centigradi e rinnovare il mezzo cellulare. Per mantenere un pH neutro durante l'acquisizione di immagini in contrasto di fase, sostituire il coperchio della piastra con uno in vetro dotato di una sottile striscia di paraformaldeide.

Coprire il lato della piastra per prevenire l'evaporazione quando si utilizza un obiettivo a immersione in olio. Posizionare una goccia di liquido di immersione sulla posizione dell'obiettivo. Posizionare la piastra contenente il gel di collagene sul palco del microscopio in modo che la piastra entri in contatto con il liquido di immersione.

Mettere a fuoco il campione e cercare le cellule di interesse da acquisire per ridurre al minimo la deriva del palchetto. Lasciare stabilizzare la piastra per circa 45 minuti. Prima di iniziare un'acquisizione prolungata, impostare i parametri di acquisizione delle immagini per esperimenti con aggiunta di inibitore.

Preparare il mezzo integrato con il farmaco a una concentrazione lavorativa desiderata. Rinnovare il mezzo cellulare per mantenere un pH neutro, ma non sigillare con perfil. Trasferire il campione al microscopio ed eseguire l'acquisizione delle immagini al momento del trattamento con il farmaco.

Mettere in pausa l'immagine, acquisire e rimuovere con attenzione il coperchio della piastra senza disturbare la piastra stessa. Aspirare il mezzo e pipettare nel piatto il mezzo contenente il farmaco. Quindi reinserire con cura la piastra.

La configurazione superiore per la FRAP varia tra i diversi sistemi. Consultare quindi le istruzioni del produttore. Impostare innanzitutto i parametri per l'acquisizione di immagini di cellule vive.

Per il fotoblesciamento. Testare questi parametri su cellule di prova per ottenere una potenza laser sufficiente da fotoblesciare il segnale fluorescente senza danneggiare la cellula. Successivamente, avviare l'acquisizione delle immagini sul campione, acquisendo almeno cinque fotogrammi.

Quindi effettuare il fotoblesciamento della regione di interesse. Continuare ad acquisire durante il tempo di recupero. Misurare l'intensità fluorescente media dell'area fotoblesciata prima e dopo il fotoblesciamento nel tempo, utilizzando un software di analisi statistica.

Adattare la curva di recupero all'equazione esponenziale. Ottenere i parametri relativi al tempo di dimezzamento e all'intensità finale dalla curva di adattamento esponenziale. Quindi calcolare la frazione mobile prendendo il rapporto tra l'intensità finale e quella iniziale della fluorescenza.

Queste immagini di cellule vive in 3D mostrano cellule epiteliali sane che esprimono l'actina GFP. Dopo quattro giorni di coltura, queste cellule hanno formato un cisto in una matrice di collagene 3D. Alcune cellule hanno migrato lungo la superficie del cisto, mentre altre hanno migrato all'interno del cisto.

La deformazione della matrice, causata dalle forze di trazione esercitate da cellule in migrazione, viene analizzata attraverso lo spostamento di particelle traccianti incorporate nella matrice circostante. Qui viene mostrato l'effetto dell'inibizione della chinasi RO sulle forze di trazione. I movimenti delle particelle traccianti sono visualizzati come immagine di proiezione massima di diversi punti temporali, e ciascun punto temporale è colorato in modo pseudocromatico.

In alternativa, le immagini di una singola particella tracciante vengono visualizzate come un montaggio per mostrare il movimento della particella tracciante. Nel tempo, questa particella tracciante si è spostata verso e lontano dal margine posteriore della cellula in migrazione, rispettivamente prima e dopo l'aggiunta di Y 2 7 6 3 2. L'analisi frap segue cellule che esprimono actina GFP mentre migrano in una matrice tridimensionale, indicando un tipico recupero della fluorescenza. Dopo un esperimento di foto-bleaching con impostazioni laser ottimizzate, l'intensità di fluorescenza della regione di interesse risulta visibilmente ridotta rispetto al livello di fondo, mantenendo al contempo cellule sane e non danneggiate.

Questo grafico mostra l'adattamento della curva di recupero a una funzione esponenziale. Una volta acquisita padronanza, la semina delle cellule nella matrice può richiedere un'ora. Non dimenticare che lavorare con tre amino propil trimetil può essere estremamente pericoloso.

Pertanto, adottare precauzioni come lavorare sotto cappa chimica. Ricordare inoltre di mantenere condizioni sterili quando si lavora con cellule in una matrice tridimensionale.