Applicazione di MassSQUIRM per le misure quantitative delle attività demetilasi lisina

Il protocollo mass squirm mira a quantificare l'attività della lisina desmetilasi utilizzando la metilazione isotopica e la spettrometria di massa MALDI. In primo luogo, si eseguono reazioni enzimatiche di desmetilazione su peptidi contenenti lisina metilata. Successivamente, si metilano chimicamente i prodotti peptidici della reazione di desmetilazione con formaldeide deuterata per generare peptidi uniformemente metilati che ionizzano nello stesso modo mediante MALDI. Si procede quindi a quantificare ciascuna specie peptidica mediante spettrometria di massa e si tiene conto dell'overlap isotopico. Al fine di identificare le quantità relative di peptidi metilati in forma non, mono, di e trimetilata, i risultati del mass squirm determinano le quantità relative di ciascun prodotto della reazione di desmetilasi in base alle variazioni di massa.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la spettrometria di massa su coltura tradizionale, è che il punteggio di massa tiene conto delle differenze di ionizzazione tra peptidi con diverso grado di metilazione. Abbiamo concepito per la prima volta questa strategia quando abbiamo sviluppato un metodo per misurare i livelli di acetilazione delle istoni utilizzando anidride acetica isotopicamente pesante. La difficoltà principale di questa tecnica consiste nell'estrazione dei dati relativi all'area dei picchi, che può risultare complicata dall'overlap degli involucri isotopici dei peptidi.

Per la reazione della desmetilasi, combinare 125 nanogrammi di enzima ricombinante lisina-specifica desmetilasi uno con 0,25 microgrammi di peptide di istone H3 dimetilato biotinilato in un volume finale di 20 microlitri di tampone per desmetilasi. Preparare inoltre un campione di controllo contenente 0,25 microgrammi di peptide senza l'enzima LSD1 e incubare i tubi della reazione e del controllo per due ore a 37 gradi Celsius. Successivamente, per preparare R2, perle porose da 20 micron, mescolare volumi uguali di perle e metanolo.

Quindi aggiungere 10 volumi di acido trifluoroacetico (TFA), aggiungere otto microlitri di perle porose a ogni campione e agitare per 15 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, condizionare due zip tip C18. Pipettare due volte con 20 microlitri di TFA 0,1%, quattro volte con acetonitrile 70% in TFA 0,1% e nuovamente quattro volte con TFA 0,1%.

Successivamente, caricare i due campioni sui puntali zip condizionati. Con una pipetta, spingere il volume attraverso la resina C 18. Ripetere fino a quando l'intero volume di entrambi i campioni è stato fatto passare attraverso i puntali zip.

Quindi lavare le punte a zip due volte con 20 microlitri di TFA 0,1%, eluire i campioni in 40 microlitri di buffer illusione e procedere all'essiccazione completa mediante un concentratore a vuoto. Per prima cosa risospendere il campione in 100 microlitri di buffer fosfato 50 millimolare a pH 7,4. Quindi aggiungere otto microlitri di dimetilammina borica e 16 microlitri di formaldeide deradata.

Incubare a quattro gradi Celsius per due ore. Ripetere la metilazione riduttiva aggiungendo dimetilammina normale e formaldeide deuterata e incubare per due ore. La terza volta, aggiungere dimetilammina normale e incubare a quattro gradi Celsius per 15 ore.

Terminare la reazione aggiungendo 12,5 microlitri di tris uno molare, pH 7,4, quindi portare a completo essiccamento con un concentratore a vuoto. Per prima cosa, risospendere i campioni di controllo e quelli della reazione con la desmetilasi in 100 microlitri di tampone fosfato 50 millimolare, pH 7,4.

Ora aggiungere otto microlitri di perle porose ai campioni di controllo e alle reazioni della demetilasi e raccoglierli su zip tip come mostrato in precedenza. Eluire in volumi di due microlitri su una piastra campione per MALDI e lasciare essiccare a temperatura ambiente fino alla cristallizzazione. Procedere con l'analisi dei campioni mediante spettrometria di massa.

Aprire i file spettro nel software di elaborazione ed esportarli nel software M su Z. Verificare ulteriormente i prodotti della reazione mediante spettrometria di massa in tandem. Innanzitutto, determinare il rapporto tra l'area dei picchi degli isotopi carbonio 13 C due e carbonio 13 C quattro rispetto al picco mono-isotopico per il campione di controllo.

Utilizzare questi rapporti calcolati per quantificare la quantità relativa di peptide presente in ciascuna modificazione. Stato del campione della reazione di desmetilazione. L'enzima LSD1 può essere efficacemente utilizzato nella quantificazione tramite spettrometria di massa della desmetilazione della lisina.

Poiché la reazione di controllo non subisce metilazione riduttiva, indica l'abituale profilo isotopico per questo peptide. Le aree dei picchi risultanti determinano i rapporti di fondo del peptide esistente in carbonio 13 C due e carbonio 13 C quattro. Gli stati isotopici, insieme alle aree dei picchi dello spettro di massa della reazione di controllo, permettono la quantificazione della quantità relativa di peptide presente in ciascuno stato di modificazione. Nella reazione della demetilasi, le aree dei picchi di queste reazioni di controllo e della reazione della demetilasi indicano il 33,7% di lisina 4 dimetilata, il 42,0% di lisina 4 monometilata e il 24% di lisina 4 non metilata.

Questo approccio di massa su squame offre spunti fondamentali nel campo dell'epigenetica degli istoni, ad esempio su come la demetilazione dei residui di lisina negli istoni contribuisca a diverse malattie. Sebbene questo saggio di metilazione sia stato applicato per lo studio delle demetilasi, può essere utilizzato anche per lo studio delle metiltransferasi.