Microcapsule di alginato come piattaforma 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) per diverse linee

Questo protocollo è ottimizzato per incapsulare cellule staminali embrionali umane pluripotenti e differenziarle in neuroni dopaminergici in un sistema 3D. In primo luogo, trattare le colonie con inibitore della chinasi ROCK o RI e dissociarle in singole cellule con acuato mescolato con alginato di sodio, quindi farle passare attraverso il dispositivo di incapsulamento. Continuare il trattamento con RI per tre giorni, trasferire le cellule incapsulate su cellule PA6 e differenziarle per 28 giorni.

In definitiva, l'analisi dell'espressione genica e proteica mostra una maggiore efficienza nella generazione di neuroni dopaminergici. Il principale vantaggio di questa particolare tecnica rispetto al protocollo di differenziazione 2D esistente è che si cerca di propagare e differenziare queste cellule in un ambiente 3D, il quale fornisce l'opportunità di propagare le cellule in maniera ad alta densità. Inoltre, consente anche una migliore interazione tra cellula e cellula durante il processo di differenziazione.

E in terzo luogo, offrirvi anche una maggiore efficienza di differenziazione nel corso del tempo. Inoltre, se posso aggiungere, questa particolare tecnica può essere adattata anche per altri tipi di cellule che possiamo coltivare in un ambiente 3D. Ricordate anche, ad esempio, che questa particolare tecnica è stata ottimizzata utilizzando un specifico inibitore della chinasi ROCK, che previene l'apoptosi cellulare e impedisce il distacco delle cellule dalle piastre di coltura.

Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà iniziali, poiché questa tecnica non viene tipicamente eseguita nella coltura di tessuti. La seguente tecnica di incapsulamento è stata ottimizzata sulla base degli studi riassuntivi del Dott. Dean e del Dott. Chad sull'applicazione dell'alginato di tipo inibitore R, sulla concentrazione di alginato e sulle impostazioni del dispositivo di incapsulamento. Jamie e Kim, uno studente di dottorato del nostro laboratorio, dimostreranno ora questo protocollo.

Aggiungere 25 millilitri di soluzione sterile di gelatina allo 0,1% a 275 milligrammi di alginato di sodio purificato in un tubo sterile da 50 millilitri e vorticare per dissolvere parzialmente la polvere di alginato. Successivamente, posizionare il tubo su un miscelatore orbitale a 10 volte G durante la notte. Poi aggiungere cloruro di sodio sterile al 9% alla soluzione di alginato.

Vortexare per 30 secondi, quindi centrifugare a 95 ×g per cinque minuti. Conservare la soluzione di alginato a quattro gradi Celsius. Per prima cosa, in un ambiente al buio, pretrattare le cellule staminali embrionali umane con mezzo di coltura integrato con 10 micromolar di inibitore di ROCK.

Incubare per due ore a 37 gradi Celsius. Lavare ora le cellule due volte con DPBS per staccare le cellule enzimaticamente. Aggiungere accutane e incubare per 10 minuti.

A 37 gradi Celsius, raccogliere delicatamente le cellule con uno scraper per cellule e trasferirle in un tubo da 15 millilitri. Neutralizzare l'Accutase con un volume equivalente di mezzo SL. Quindi far passare le cellule neutralizzate attraverso un filtro da 40 micron in un nuovo tubo da centrifuga da 50 millilitri.

Ora utilizzare un citometro ematico per enumerare le cellule. Raccogliere le cellule in pellet mediante centrifugazione, eliminare con attenzione il soprannatante. Quindi lavare le cellule una volta con mezzo preriscaldato.

0,9% cloruro di sodio. Centrifugare il campione e scartare il soprannatante. Per incapsulare le cellule staminali embrionali umane, iniziare risospendendo le cellule in una soluzione di alginato preriscaldata.

Per fare ciò, collegare una siringa da 20 millilitri a un tubo di plastica morbida ed aspirare l'alginato nella siringa. Quindi, mescolare delicatamente la sospensione cellulare utilizzando la siringa senza formare bolle. Ora aspirare le cellule nella siringa.

Scartare il tubo di plastica e quindi collegare la siringa alla macchina di incapsulamento. Procedere con la configurazione degli strumenti del generatore di perle, della pompa per siringa, del misuratore di flusso d'aria e del bagno di precipitazione di cloruro di calcio. Verificare che vi sia un intervallo di 10 centimetri tra l'estremità della macchina di incapsulamento e il punto di raccolta della piastra di Petri.

Successivamente, impostare la pompa per siringa a 10 millilitri all'ora. Portata d'aria a otto litri al minuto e una pressione di 100 chilopascal. Raccogliere le cellule incapsulate in un bagno di precipitazione preriscaldato per sette minuti.

Quindi trasferirli mediante aspirazione delicata in un tubo da centrifuga da 50 millilitri contenente 20 millilitri di cloruro di sodio 0,9%, lasciare sedimentare le capsule sul fondo del tubo, eliminare delicatamente il soprannatante e lavare una volta con cloruro di sodio 0,9%. Procedere quindi a risospendere le cellule incapsulate in mezzo di coltura preriscaldato, integrato con inibitore ROCK. Trasferire in una fiala da coltura e incubare per tre giorni.

Sezionare le cellule della linea stromale murina PA six in un fiasco T75 rivestito con gelatina 0,1% e condizionare il mezzo di differenziamento neurale dopaminergico per 24 ore. Trasferire le capsule in un tubo da centrifuga da 50 millilitri e lasciarle sedimentare sul fondo del tubo. Scartare il sopranatante e risospendere le capsule nel mezzo di differenziamento neurale dopaminergico condizionato con cellule PA six.

Cultura media. Le cellule staminali embrionali umane incapsulate con il monostrato di cellule PA6 per 21 giorni. Quando si rinnova il mezzo, effettuare un cambio di media.

Ogni volta, solo metà del mezzo viene utilizzato per continuare la coltura delle cellule PA6 in differenziazione neurale dopaminergica. Il mezzo viene integrato con fattori induttori per una settimana. Aspirare innanzitutto le capsule e trasferirle in un tubo centrifugo da 15 millilitri.

Una volta che le capsule si sono depositate sul fondo, eliminare il soprannatante. Lavare due volte con DPBS, eliminando ogni volta il soprannatante. Quindi aggiungere cinque millilitri di soluzione decap ululating e mescolare accuratamente la sospensione.

Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver centrifugato il pellet, recuperare le cellule e lavarle due volte con DPBS; procedere quindi all'utilizzo delle cellule sia come coltura in monostrato sia per analisi immediate a valle. In una preparazione tipica, il diametro dei microcapsuli di alginato è compreso tra 400 e 500 micron.

Qui, saggio C-F-D-A-P-I. I risultati determinano le cellule verdi vitali e incapsulate all'80%. Analisi della vitalità, della proliferazione e dell'apoptosi di cellule staminali embrionali umane incapsulate in diversi punti temporali servono a ottimizzare le condizioni di coltura. In modo interessante, gli effetti dell'inibitore della chinasi ROCK prevengono l'apoptosi indotta dalla dissociazione e mantengono la vitalità cellulare, con un'indicazione di crescita superiore delle cellule staminali embrionali umane incapsulate coltivate in H-F-F-C-M più ri.

In questo esempio, l'incapsulamento cellulare viene applicato come piattaforma tridimensionale per differenziare cellule staminali embrionali umane incapsulate in neuroni dopaminergici. Come previsto, le dimensioni dei corpi embrionali aumentano nel tempo; dopo due o tre giorni di coltura, le cellule mostrano una morfologia neuronale progressiva con una vitalità superiore al 90%. L'analisi dell'espressione genica indica una riduzione del marcatore di pluripotenza OCT4.

È importante notare che il marcatore dei progenitori neurali PAC six e il marcatore dei neuroni dopaminergici th rimangono sovraespressi dopo sette giorni di differenziamento. Cellule staminali embrionali umane ulteriormente differenziate mostrano oltre il 90% di neuroni positivi per TH dopo 21 giorni. L'analisi di western blot conferma i profili di espressione favorevoli di TH e PAC six nei sistemi di coltura cellulare in 3D rispetto a quelli in 2D.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita efficacemente in due ore. Ricordarsi di trattare le cellule con l'inibitore della rock prima e dopo l'incapsulamento. Induttori o inibitori diversi possono essere adattati al protocollo di differenziazione 3D per esperimenti futuri.

Questa particolare tecnica di incapsulamento delle ESL umane e della loro differenziazione in un ambiente 3D ha un potenziale per la terapia cellulare di numerose malattie, in particolare il morbo di Parkinson.