Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno

In questa procedura, mostriamo un approccio di microscopia intravitale quantitativa per valutare la dinamica del passaggio del parassita attraverso la milza. In un modello di malaria su roditore, topi infettati con parassiti transgenici GFP vengono preparati per la microscopia intravitale; la cannullatura della vena splenica permetterà l'iniezione di coloranti intravitali. Durante l'esperimento, le cellule fluorescenti vengono osservate mentre si muovono in diverse aree della milza.

Forniamo la metodologia per descrivere la mobilità del parassita nel compartimento lento tridimensionale della polpa rossa e per calcolare il flusso sanguigno nei vasi. Questi parametri sono stati utilizzati per confrontare la dinamica splenica di due ceppi PULE. Ciao a tutti.

Il mio nome è Nando El Portillo e una delle principali domande di ricerca nel mio laboratorio è cercare di comprendere il ruolo della milza nella malaria. La splenomegalia è uno dei segni caratteristici di questa malattia, ma a causa di problemi tecnici ed etici, condurre studi su questo organo è molto difficile. Per riuscirci, abbiamo sviluppato tecnologie che ci permettono di osservare il passaggio dinamico di questo parassita e di quantificare questo fenomeno.

Questo è ciò che Lorena e MI spiegheranno in questi protocolli. Questa ricerca viene condotta in parte in collaborazione con i gruppi del Dott. Ler dell'Università di Amburgo in Germania e della Dott.ssa Maria Kbo presso l'ospedale Clinic, ed è stata finanziata in generale dalla fondazione Cellex e dal ministero CIA. L'infezione in spagnolo viene avviata dal donatore M infettato con parassiti GFP letali o non letali al 10% di parassitemia. Per verificare la presenza di parassiti, prelevare una piccola goccia di sangue dalla vena della coda del topo ed estenderla su un microscopio.

Fare scorrere una colorazione metrica colinica con soluzione GIMs. Una soluzione permetterà la visualizzazione dei globuli rossi infetti una volta essiccata; fissare lo striscio ematico con metanolo per due minuti, applicare la soluzione GIMs e incubare per 20 minuti. Lavare il vetrino con acqua corrente del rubinetto ed essiccare; enumerare la percentuale di PBC rispetto al totale dei globuli rossi utilizzando un microscopio ottico con obiettivo ad immersione 100x.

Infetta i topi con parassiti letali o non letali ottenuti dal sangue della coda di topi donatori, diluiti in PBS. Regola la dose iniettando mezzo milione di parassiti per topo, al fine di raggiungere un livello periferico di parassiti pari all'1% al terzo giorno post-infezione, e inietta per via intraperitoneale. In alternativa, come controllo si possono utilizzare globuli rossi marcati con FITC.

Prelevare un millilitro di sangue arterioso da un topo e lavare il pellet mediante centrifugazione in PBS contenente EDTA; quindi incubare in soluzione con FITC per due ore al buio con agitazione delicata. Trascorso tale periodo, rimuovere il soprannatante mediante centrifugazione e lavare accuratamente. Iniettare in un topo controllo per ottenere una media dell'1% in circolazione periferica e procedere quindi con esperimenti in vivo.

Ciao, sono Mija. Per ottenere un'immagine del milza in vivo, dobbiamo eseguire una piccola laparotomia sull'animale per esporre il milza; ovviamente questa tecnica. L'ho imparata da Stephanie GR nel laboratorio di Worker Heisler, a cui desidero esprimere la mia gratitudine, e ora vi mostrerò come procedere.

Immagini di miociti infetti eseguite al terzo giorno post-infezione, quando la parat è dell'1% in entrambi i ceppi. Mantenere il topo anestetizzato e a temperatura regolata per tutta la durata della procedura. Proteggere gli occhi dalla disidratazione e verificare che il topo sia completamente anestetizzato pizzicando la pianta del piede prima di procedere, al fine di facilitare la somministrazione endovenosa delle sostanze.

Durante l'esperimento, cannuccia la vena della coda del topo per costruire la cannula. Inserire un piccolo ago in un'estremità di un tubo e il suo applicatore nell'altra estremità. Riempire la cannula con soluzione salina fisiologica eliminando le bolle d'aria e verificare che la soluzione scorra correttamente attraverso la cannula.

La vena laterale della coda verrà cannullata in modo accurato. Aumentare la sua visibilità eseguendo una leggera costrizione alla base della coda. Introdurre la punta della cannula all'interno della vena.

La comparsa di sangue indicherà che l'ago è posizionato correttamente. In caso contrario, ripetere la cannulazione a monte della vena, quindi fissare la cannula alla coda utilizzando colla e nastro adesivo. Esporre la parte inferiore della milza attraverso una piccola incisione nella cute e nella muscolatura sul lato dorsale sinistro dell'animale.

Posizionare una milza dove si osserva un movimento respiratorio minore e applicare PBS sulla superficie esposta per mantenerla priva di peli del topo e idratata. Sigillare la milza con un vetrino per permettere la visualizzazione. Ciao, mi chiamo Lorena.

Il protocollo illustrato ci permetterà di visualizzare il movimento dei parassiti PULI attraverso la milza. Questo è stato possibile grazie ai parassiti transgenici GFP. Donazione gentilmente fornita da James Burnes della Drexel University.

L'osservazione del movimento di parassiti fluorescenti ci permetterà di determinare se esistono differenze nel comportamento tra ceppi letali e non letali. Gli esperimenti di microscopia intravitale sono stati eseguiti con un microscopio Leica a multiphotoni, dotato di un sistema di incubazione con controllo della temperatura e di un obiettivo a glicerolo 63x. Posizionare l'animale sul portapreparati del microscopio con la milza coperta rivolta verso il basso, in direzione dell'obiettivo. Inizialmente.

La visualizzazione della milza a ingrandimenti inferiori fornirà una visione generale della struttura microcircolatoria dell'organo. Mettere a fuoco la milza utilizzando i parassiti GFP a fluorescenza autonoma che si osservano attraversare le diverse aree della milza. Ciao, mi chiamo Maria Albo dei Centri Scientifici e Tecnologici dell'Università di Barcellona, e realizzeremo un'immagine intravitale della milza.

Per studiare il flusso sanguigno e la mobilità dei globuli rossi infetti, utilizzeremo un microscopio confocale dotato di scansione risonante che consente un'acquisizione ad alta velocità, molto utile per evitare il movimento dell'organo. Si tratta di un microscopio spettrale che permette di selezionare l'intervallo di visione. Per ottenere immagini molto rapidamente, effettueremo l'acquisizione simultanea dei due marcatori fluorescenti e della riflessione.

Selezionare diverse zone da immaginiare avvalendosi dei coloranti RBC, di riflessione, di contrasto e di Vidal per evidenziare la microvascolatura della milza. Spiegheremo ora come misurare la mobilità dei parassiti nel flusso sanguigno dei vasi mediante microscopia di Vidal e software ImageJ per seguire il movimento dei parassiti nella rete tridimensionale della polpa rossa. Acquisire immagini attraverso cinque profondità Z utilizzando una modalità di scansione ad alta velocità.

Convertire pile di immagini in filmati colorati codificati in Z per facilitare il tracciamento di singole cellule fluorescenti. Nella descrizione sono fornite informazioni dettagliate per tracciare diverse particelle nel tempo in base alla profondità di ciascun video; utilizzando le coordinate X, Y, Z e T, possono essere calcolati parametri di mobilità come direzionalità, velocità media e tempo di permanenza, che possono quindi essere rappresentati mediante mappe di distribuzione per consentire analisi comparative tra popolazioni di ceppi. Il flusso vascolare nella milza può essere visualizzato mediante iniezione sistemica di diverse molecole fluorescenti descritte nella tabella supplementare, come la destrina.

E utilizzando la scansione endogena con contrasto di riflessione degli eritrociti, analizzare il flusso sanguigno lungo la linea centrale posizionando i vasi orizzontalmente rispetto alla direzione della scansione laser e applicando una media avanzata della linea. In queste immagini, le tracce risultanti dal movimento delle cellule verranno utilizzate per calcolare il flusso ematico; acquisire immagini di vasi con diversi diametri e durante il ciclo cardiaco per compensare le fluttuazioni. La milza è stata a lungo considerata una "scatola nera" nella ricerca sulla malaria e, in questo studio, abbiamo sviluppato un approccio quantitativo di microscopia intravitale per ottenere informazioni sulle dinamiche dell'infezione parassitaria e sul flusso sanguigno in questo organo, permettendoci di affrontare importanti quesiti biologici, come l'adesione in vivo dei globuli rossi infetti alla milza.

Grazie e.