Costruire un idrogel collagene per la fornitura di Stem Cell-loaded Chitosan Microsfere

Questo protocollo descrive una strategia in vitro per veicolare cellule staminali da microsfere di chitosano in un impalcatura di gel di collagene, nonché per raccogliere e coltivare le cellule. Le cellule staminali adipocitarie primarie vengono quindi emulsionate e recuperate insieme a una preparazione di microsfere di chitosano. Successivamente, si seminano le cellule staminali sulle microsfere di chitosano e si coltivano in un inserto per piastra da coltura con membrana di dimensione dei pori di otto micron, al fine di produrre un CSM caricato con CS; infine, si mescola il sistema di somministrazione a base di microsfere con un impalcatura tridimensionale di gel di collagene.

In definitiva, questo sistema CSM offre potenzialità per l'uso in medicina rigenerativa e nel rilascio di farmaci. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'iniezione cellulare o la microincapsulazione, è la capacità delle cellule di aderire a un materiale di trasporto e di persistere dopo l'applicazione iniziale. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà perché le microsfere esan possiedono una carica elettrostatica intrinseca.

Caricare le cellule su un letto di microsfere sarà difficoltoso senza perturbare le cellule stesse. Escidere e lavare il tessuto adiposo perineale ed epidermico da un mincione di tessuto, quindi trasferire da uno a due grammi in 25 millilitri di HBSS contenente 1% di FBS. Dopo la centrifugazione, raccogliere lo strato di tessuto adiposo in superficie in un matraccio Erlenmeyer da 125 millilitri.

Aggiungere 25 millilitri di collagenasi di tipo due e incubare la reazione su un agitatore orbitale. Rimuovere ora con attenzione la frazione liquida al di sotto dello strato oleoso e adiposo e filtrare in sequenza attraverso filtri in maglia di nylon da 170 micron. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione dopo due lavaggi con 25 millilitri.

HBSS Resus, sospendere il pellet in 30 millilitri di mezzo di crescita Mesen Pro integrato. Suddividere le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo purificate in due fiasche da coltura T75 e amplificare la preparazione di ASC in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Questo protocollo CSM è un processo di emulsionamento di acqua in olio che utilizza una tecnica a coerenza ionica.

Emulsionare sei millilitri di una soluzione acquosa di chitosano in 100 millilitri di una miscela di fase oleosa utilizzando contemporaneamente agitazione meccanica e magnetica in direzioni opposte per un'ora fino a ottenere un'emulsione stabile di acqua e olio; aggiungere 1,5 millilitri di idrossido di potassio al 1% in n-ottano ogni 15 minuti per quattro ore. Al termine della reazione di reticolazione ionica, decantare lentamente la fase oleosa e aggiungere immediatamente le sferette a 100 millilitri di acetone. Lavare le sferette con acetone fino a completa rimozione della fase oleosa.

Quindi asciugare le sfere recuperate in vuoto. Disidratare per determinare la dimensione media delle particelle di CSM, l'area superficiale per milligrammo e il volume cubico unitario mediante analizzatore di dimensione delle particelle. Procedere quindi a lavare il CSM tre volte con acqua sterile per rimuovere i sali residui.

Ora sterilizzare la preparazione di CSM con alcol assoluto per l'uso in esperimenti cellulari in un tubo di vetro da 50 millilitri, mescolare cinque milligrammi di microsfere con un millilitro di soluzione di TNBS 0,5% e incubare per quattro ore a 40 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere tre millilitri di acido cloridrico sei normali e incubare a 60 gradi Celsius per due ore. Dopo aver raffreddato i campioni a temperatura ambiente, aggiungere cinque millilitri di acqua deionizzata e 10 millilitri di etere etilico.

Per estrarre il TNBS libero, prelevare un’aliquota di cinque millilitri della fase acquosa e riscaldare a 40 gradi Celsius in un bagno a temperatura controllata per 15 minuti per evaporare l’etere residuo, dopo aver raffreddato a temperatura ambiente. Diluire con 15 millilitri di acqua e utilizzare uno spettrofotometro. Misurare l’assorbanza delle microsfere di chitosano preparate a 345 nanometri utilizzando il TNBS come bianco.

Misurare anche il chitosano utilizzato per la preparazione del CSM. Calcolare ora il numero di gruppi amminici liberi del CSM rispetto al numero totale di gruppi amminici presenti nel chitosano. Equilibrare cinque milligrammi di CSM sterilizzato in HBSS sterile durante la notte.

Trasferire il CSM su un inserto con membrana da otto micron per piastre da coltura a 24 pozzetti. Dopo che il CSM si è depositato, aspirare con attenzione l'HBSS. Aggiungere ora 300 microlitri di mezzo di crescita all'interno dell'inserto e 700 microlitri di mezzo di crescita all'esterno dell'inserto. Resus.

Sospendere le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo in 200 microlitri di mezzo di crescita e seminare sopra la membrana CSM all'interno della piastra da coltura. Incubare per 24 ore in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Trasferire la CSM caricata con le cellule staminali in un tubo microcentrifuga sterile senza disturbare le cellule che hanno migrato all'interno della membrana dell'inserto.

Ora rimuovere il mezzo residuo e aggiungere 250 microlitri di mezzo di crescita fresco in ogni provetta. Aggiungere 25 microlitri di soluzione di MTT a cinque milligrammi per millilitro e incubare per quattro ore. Rimuovere i mezzi e aggiungere 250 microlitri di dimetilsolfossido, vorticiare per solubilizzare il complesso formazan, quindi centrifugare il CSM a 2.700 ×g per cinque minuti.

Misurare l'assorbanza del sopranatante a 570 nanometri utilizzando 630 nanometri come riferimento. Procedere quindi a determinare il numero di cellule associato al CSM in relazione al valore di assorbanza ottenuto da numeri noti di A SC vitali. Mescolare cinque milligrammi di un CSM caricato con SC con 7,5 milligrammi per millilitro di collagene di tipo uno estratto dal ratto.

Tendine della coda, aggiustare il pH a 6,8 utilizzando idrossido di sodio due normale e versare in una piastra per colture. Inserire per fibrillare, quindi trasferire in una piastra a 12 pozzetti e incubare per 30 minuti. Continuare a rinnovare il mezzo per i gel di collagene A-S-C-C-S-M ogni due giorni durante il periodo di incubazione.

Monitorare anche il rilascio e la migrazione delle cellule dai microsfera di chitosano (CSM) nel gel, utilizzando tecniche standard di microscopia. Questo esempio seguente descrive la strategia in vitro per il rilascio di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo da microsfere di chitosano in uno scaffold di gel di collagene. Le immagini ottenute con microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) indicano una preparazione di CSM porosi di dimensioni uniformi.

L'incubazione delle microsfere con cellule staminali derivate dal tessuto adiposo primarie indica 4.000 cellule per milligrammo di CSM calcico am. La colorazione di una SC mostra una diffusione sulla CSM con protrusione di filopodi nelle interstizi porosi della microsfera. Quando le CSM cariche di cellule sono state mescolate con il gel di collagene, le cellule migrano nel gel e possono essere seguite nel tempo.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono immediatamente alla terapia della perdita di tessuto massiva e cronica. Tuttavia, questo regime terapeutico ha un potenziale molto maggiore grazie alla sua versatilità nell'integrarsi con una varietà di cellule e/o biomateriali utilizzati per trattare diversi livelli di perdita di tessuto molle e cardiaco. È probabile che questo metodo possa fornire informazioni sul rilascio di cellule ospiti.

È inoltre applicabile ad altri sistemi, come formulazioni iniettabili, somministrazione di farmaci terapeutici e sviluppo di sistemi ibridi per la consegna simultanea di cellule e farmaci terapeutici.