In Assemblea in vitro di semi-artificiale della macchina molecolare e il suo utilizzo per il rilevamento del danno al DNA

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come assemblare e utilizzare un sensore di danno al DNA a doppia marcatura che etichetta due principali tipi di rotture del DNA in sezioni di tessuto. Il sensore è composto da un oligonucleotide di DNA tumorale 30, doppio marcato con ZI e Rumine, e da un enzima, la vaccinia topo isomerasi uno o vac topo, che si assembla autonomamente. Quando la vac topo si lega al tumorale 30, il funzionamento del sistema inizia quando la topo scinde l'oligonucleotide all'estremità tre prime della sequenza di riconoscimento, generando un'unità marcata con fitzy attivata da vac topo e un'ansa libera marcata con ammina.

Con un idrossile terminale in posizione tre-prime, le unità hanno vita breve e vengono rapidamente riassemblate nella struttura originale, che successivamente viene scissa. In assenza di ulteriori rotture nel DNA extramolecolare, queste due unità si separano e si ricombinano in modo ciclico e continuo. Quando il sensore molecolare viene applicato a sezioni di tessuto con danni al DNA, l'unità rivelatrice marcata con Fitz si lega selettivamente alle rotture del DNA con estremità ottuse e idrossile in posizione cinque-prime.

L'unità detector marcata con il dominio R si legherà a un'estremità ottusa dotata di fosfato in posizione cinque-prime. Se è presente la DNA ligasi T4, i risultati ottenuti mostrano la presenza e distribuzione delle rotture di tipo DNA1 e DNA2 nelle cellule, in base alla microscopia a fluorescenza. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per la rilevazione degli HESI, come il test TUNEL, è la maggiore specificità e la capacità di fornire informazioni aggiuntive marcando sia le fasi autonomi che quelle fagocitiche dell'apoptosi.

Da un punto di vista della nanotecnologia, il sensore rappresenta un approccio bio-abilitato che adatta strutture e architetture biologiche reali alla costruzione di dispositivi non tossici su scala molecolare. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché il suo successo dipende dall'utilizzo di una preparazione altamente attiva di Toro SOM e dalla corretta lavorazione delle sezioni per evitare un'eccessiva digestione da parte della proteinasi K. Le sezioni di tessuto per questa procedura devono essere preparate prima dell'assemblaggio del dispositivo molecolare. Sezioni spesse da cinque a sei micron tagliate da paraformaldeide.

Si raccomandano blocchi di tessuto fissati in paraffina. Posizionare il vetrino con la sezione di tessuto su un portavetrini e rimuovere la paraffina con xilolo per 15 minuti. Dopo 15 minuti, trasferire in un bagno fresco di xilolo per ulteriori cinque minuti.

Ridratare il campione passando il vetrino attraverso queste concentrazioni graduate di etanolo: 96% etanolo due volte per cinque minuti ciascuna, 80% etanolo per cinque minuti, seguito da acqua.

Due volte per cinque minuti ciascuna. Dopo la reidratazione, digerire il campione con proteinasi K. Utilizzando 100 microlitri di una soluzione di 50 microgrammi per millilitro per sezione, incubare per 15 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata. A seconda del tipo di tessuto, potrebbe essere necessario regolare il tempo di digestione, ma prestare attenzione a non eccedere nella digestione poiché provoca la scomparsa del segnale e il danneggiamento del campione al termine della digestione.

Sciacquare il vetrino due volte con acqua distillata, per 10 minuti ciascuna. Applicare BSA al 2% per il pre-bloccaggio e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata. Durante questo periodo, assemblare la macchina molecolare come mostrato successivamente in questo video.

Tutti i reagenti per l'assemblaggio della macchina molecolare sono dosati per un volume totale di 25 microlitri, sufficiente per un singolo rilevamento in una sezione di tessuto di dimensioni medie. Il volume può essere aumentato secondo necessità in un piccolo tubo di plastica. Aggiungere i seguenti reagenti in quest'ordine utilizzando acqua distillata.

15% polietilene glicole 8.000, buffer per DNA ligasi T4, oligonucleotide bifunzionale vaccinia topoisomerasi I e DNA ligasi T4 mescolati delicatamente mediante pipettaggio. La costruzione molecolare si autoassemblerà quasi istantaneamente in questa soluzione e può essere utilizzata immediatamente a temperatura ambiente. Per iniziare la procedura di marcatura delle interruzioni del DNA, aspirare la soluzione di pre-bloccaggio dal vetrino.

Applicare 25 microlitri della miscela di reazione completa su ciascuna sezione. Posizionare un coprioggetto in plastica sulla sezione e inserire il vetrino in una camera umidificata. Proteggere dalla luce avvolgendo la camera con carta d'alluminio e incubare per un'ora a temperatura ambiente.

Sebbene entrambi i segnali della ligasi e della topo possano essere osservati dopo l'incubazione di un'ora, in molti casi il segnale della ligasi può essere ulteriormente potenziato. Per potenziare il segnale, riapplicare la miscela di reazione senza vac topo e oligonucleotide uno, ma con oligonucleotide tre e T four DNA Ligasi, posizionare una lamellina di plastica sulla sezione e incubare in una camera umidificata per 18 ore. Il giorno successivo, a temperatura ambiente, immergere delicatamente il vetrino verticalmente in un contenitore coplan contenente acqua a temperatura ambiente per rimuovere la lamellina.

Quindi lavare il campione con acqua distillata per tre volte, per 10 minuti ciascuna. Risciacquare il campione con tampone di bicarbonato di sodio. Questo risciacquo con soluzione alcalina potenzia la fluorescenza di fitzy, che è sensibile al pH ed è notevolmente ridotta a un pH inferiore a sette.

Infine, coprire il campione con una soluzione antigiallimento che contenga anche DPI per la controcolorazione dei nuclei e applicare una lamella. I campioni sono ora pronti per l'osservazione al microscopio a fluorescenza. Nella presente figura è mostrata una sezione di timo trattato con desametasone in cui il sistema molecolare ha rilevato frammenti di DNA di tipo uno e frammenti di DNA di tipo due con estremità tronche, rotture del DNA nelle aree corticali timiche in cui sono in atto processi di apoptosi, e una fluorescenza citoplasmatica verde indicativa di rotture del DNA di tipo due, nonché macrofagi corticali che digeriscono il materiale nucleare dei timociti apoptotici.

Questo segnale è prodotto da vac topo e si localizza nei lisosomi FGA con DNA contenente idrossile in posizione cinque prime. Interruzioni a doppio filamento con fluorescenza rossa che indica un tipo di rottura del DNA, marcatura dei nuclei di timociti apoptotici non fagocitati dai macrofagi. Un numero massiccio di timociti subisce contemporaneamente apoptosi.

Accompagnato dalla generazione di rotture a livello del doppio filamento con fosfato in posizione 5′, visualizzate mediante etichettatura basata su ligasi. Queste rotture si trovano alla periferia nucleare e formano schemi a forma di anello. Tutti i nuclei cellulari sono visualizzati in blu mediante colorazione di controstanatura con dpi.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di non far mai asciugare i campioni tra l'aggiunta di diverse soluzioni. Mantenere inoltre tutte le preparazioni enzimatiche sul ghiaccio prima di aggiungere i campioni e proteggere le sonde fluorescenti dalla luce durante la reazione di marcatura dopo lo sviluppo. La tecnica ha permesso la visualizzazione di tutte le fasi della disassemblaggio delle cellule heto.

Questo sensore in sé rappresenta un esempio dell'approccio nanotecnologico verde alla progettazione di particelle, sonde e macchine su scala nanometrica. Tale approccio combina componenti artificiali con parti di macchine molecolari presenti in natura. L'obiettivo è eliminare la tossicità e le reazioni biologiche avverse di questi materiali nano dispersi in modo elevato.